小鼠巨噬細胞系RAW 264.7向破骨細胞分化的誘導條件

耿 歡，林 琛，邢更彥

小鼠巨噬細胞系RAW 264.7向破骨細胞分化的誘導條件

耿 歡，林 琛，邢更彥

目的探討RAW 264.7細胞與向破骨細胞分化的誘導條件，以期提高破骨細胞的數量與活性。方法 采用不同濃度核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）誘導RAW 264.7細胞4 d后形成破骨細胞，并通過抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色和鬼筆環肽染色鑒定破骨細胞，骨板吸收實驗檢測破骨細胞的骨吸收活性，反轉錄酶-聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測破骨細胞功能基因TRAP、破骨細胞相關受體（osteoclast-associated receptor，OSCAR）、c-Fos、核轉錄因子激活的T細胞1（nuclear factor of activated T-cells 1，NFATc1）的表達。結果RAW 264.7細胞經RANKL誘導4 d后可出現大量TRAP呈陽性和纖維肌動蛋白環形成的多核破骨細胞，骨板上形成較多的骨吸收瘢痕，RT-PCR檢測到破骨細胞特殊功能基因信使核糖核酸（message ribonucleic acid，mRNA）高表達。結論RAW 264.7誘導4 d可產生大量噬骨能力較強的破骨細胞。

RAW 264.7；破骨細胞；抗酒石酸酸性磷酸酶；核因子κB受體活化因子配體

骨的生理平衡是通過成骨細胞的骨形成與破骨細胞的骨吸收維持的[1]。破骨細胞的過度激活與功能增強會打破這種平衡，導致骨量減少，增加骨折的風險，如類風濕性關節炎、多發性骨髓瘤等疾病，因此破骨細胞的研究非常重要與有意義。破骨細胞的獲取是研究的前提，但其在骨組織中含量少，較難分離，體外誘導是獲取破骨細胞的主要方法。破骨細胞是在骨組織中由單核巨噬細胞分化來的特殊的具有吞噬骨組織功能的多核巨細胞。由于成骨細胞與破骨細胞之間OPG/ RANKL/RANK信號軸的發現[2]，使在體外誘導單核巨噬細胞融合成破骨細胞成為簡單有效的方法。RAW 264.7細胞是小鼠源性單核細胞，獲取簡單，純度較高，可以無限傳代，成為誘導破骨細胞的主流[3]。然而，RAW 264.7細胞生長較快，且容易分化，用RAW 264.7細胞誘導破骨細胞依然有很大的難度，國內外文獻對其培養與誘導的條件有很大差異，筆者主要研究RAW 264.7細胞向破骨細胞誘導分化的適宜條件，為后續研究破骨細胞的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 DMEM高糖培養基、胎牛血清（Gibco公司，美國）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（Sigma，美國）；核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）（R&D，美國）；24孔破骨活性測定板（Coning，美國）；鬼筆環肽染色液（Invitrogen，美國）；RAW 264.7小鼠單核巨噬細胞系購自北京協和細胞庫；熒光倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本）；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（Bio-rad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 RAW 264.7細胞培養與接種的密度梯度 RAW 264.7細胞生長迅速且容易分化，而狀態較好的RAW 264.7細胞是誘導破骨細胞的關鍵，RAW 264.7細胞的培養血清56 ℃滅活30 min[4]，吹打傳代，用于誘導的RAW 264.7細胞要為未分化的圓形。因為RAW 264.7細胞生長較快，且誘導需要4 d，誘導前密度梯度培養4 d，將RAW 264.7細胞按（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50）×104/cm2的密度接種到24孔板中，培養4 d后用1%的甲苯胺藍染色觀察細胞生長狀態，找出RAW 264.7細胞的最佳誘導密度。

1.2.2 破骨細胞誘導與TRAP染色 根據密度梯度培養結果將RAW 264.7細胞以5×103/cm2的密度接種到48孔板中，加用50 ng/ml的高濃度RANKL誘導破骨細胞，并于24、48、72、96 h分別進行TRAP染色，觀察破骨細胞形態變化。同樣密度將RAW 264.7細胞接種到48孔板中，設置對照組與不同RANKL濃度誘導組，過夜貼壁后，對照組正常培養，未加任何處理，誘導組分別加用5、10、20、50 ng/ml的RANKL誘導破骨細胞，每2 d換液。4 d后鏡下觀察到融合的破骨細胞取出48孔板，去除培養液，按照Sigma試劑盒說明書進行TRAP染色。

1.2.3 破骨細胞纖維肌動蛋白環的鬼筆環肽染色 將RAW 264.7細胞以5×103/cm2的密度接種到48孔板中，設置對照組與誘導組，對照組正常培養，未加任何處理，誘導組加20 ng/ml的RANKL，誘導4 d后，鏡下觀察到融合的破骨細胞后取出48孔板，去除培養液，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗2遍，4%多聚甲醛固定20 min后，PBS漂洗2遍，0.1%的Triton-100穿孔10 min，PBS漂洗1遍，用鬼筆環肽工作液染色30 min，回收鬼筆環肽染色液，PBS漂洗2遍，用Hoechst染色20 min，PBS漂洗1遍后于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 破骨細胞吸收功能檢測實驗 RAW 264.7細胞以5×103/cm2的密度接種于24孔骨細胞培養板中，設立對照組與誘導組，對照組正常培養，未加任何處理，誘導組加20 ng/ml的RANKL誘導破骨細胞，換液2 d/次，誘導4 d后拿出骨細胞培養板，移除培養液，ddH2O洗1遍，加入4%的次氯酸鈉漂洗5 min，移除次氯酸鈉，用ddH2O洗2遍，加入1%的甲苯胺藍染色10 min后，ddH2O洗3遍，室溫晾干，光鏡下進行觀察拍照。

1.2.5 破骨細胞的標志與功能基因檢測 將RAW 264.7細胞以5×103/cm2的密度接種于6孔板中，設置對照組與誘導組，對照組正常培養，未加任何處理，誘導組加用20 ng/ml的RANKL干預。48 h后提取總信使核糖核酸（message ribonucleic acid，mRNA），接著逆轉成與mRNA鏈呈互補的堿基序列的單鏈DNA（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），通過實時聚合酶鏈式反應（realtime-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢 測TRAP、OSCAR、c-Fos、NFATc1基因的表達。目的基因引物序列見圖1。

表1 熒光定量PCR的引物

1.3 統計學處理 應用SPSS 16.0統計學軟件分析本研究數據，計量資料采用表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。誤差棒表示（平均值）的標準誤，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 RAW 264.7細胞的形態與接種密度梯度培養結果狀態較好的RAW 264.7細胞為未分化的小圓形，生長迅速，進行密度梯度培養4 d后發現細胞接種密度為5×103/cm2時細胞重疊生長較少且基本鋪平板底，小于此密度細胞集落之間距離較大，大于此密度細胞重疊嚴重且部分細胞脫落均影響破骨細胞的誘導，因此將RAW 264.7細胞以5×103/cm2的密度接種到相應的培養板中誘導破骨細胞（圖1）。

圖1 RAW 264.7細胞不同接種密度培養4 d后甲苯胺藍染色（標尺=200μm）

2.2 RAW 264.7細胞誘導分化為破骨細胞的TRAP染色結果RAW 264.7細胞經50 ng/ml的RANKL誘導1 d后，出現少量單核的TRAP陽性細胞，誘導2 d后幾乎所有的細胞都是TRAP陽性，但未出現多核細胞，第3天開始出現多核的破骨細胞，但體積相對較小且數量較少，4 d后可見大量圓形、橢圓形的體積巨大的細胞，胞質豐富，進行TRAP染色可見為酒紅色的多核巨細胞，有的核可達上百個。RAW 264.7細胞經不同濃度的RANKL誘導4 d后，未加RANKL組未見到TRAP陽性的多核巨細胞，5 ng/ml組與10 ng/ml組出現少量小的破骨細胞，而20 ng/ml組與50 ng/ml組均出現大量的TRAP陽性的破骨細胞，因此實驗可以較低濃度的RANKL（20 ng/ml）誘導破骨細胞來提高經濟效益（圖2）。

2.3 RAW 264.7細胞誘導分化為破骨細胞的纖維肌動蛋白環染色結果RAW 264.7細胞經RANKL誘導4 d后經紅色鬼筆環肽染色可見成熟的破骨細胞纖維肌動蛋白環被染成紅色，復染Hoechst可見細胞內有大量的藍色細胞核，對照組未出現紅色的肌動蛋白環與多核細胞（圖3）。

2.4 RAW 264.7細胞誘導分化為破骨細胞的骨板吸收結果骨吸收實驗發現RAW 264.7細胞經誘導4 d后骨細胞培養板上出現大量的圓形、橢圓形、不規則形狀的白色吸收瘢痕，對照組未見吸收瘢痕（圖4）。

2.5 RAW 264.7細胞分化為破骨細胞相關基因表達結果RT-PCR結果顯示RAW 264.7細胞經RANKL誘導48 h后，經過Image J軟件灰度分析，SPSS 16.0軟件統計，發現破骨細胞分化的相關基因TRAP、OSCAR、c-Fos、NFATc1的表達均明顯高于對照組（P＜0.05，圖5）。

圖2 RAW 264.7細胞經50 ng/ml的RANKL誘導不同時間與經不同濃度的RANKL誘導4 d后的TRAP染色結果（標尺=100μm）

圖3 RAW 264.7細胞分化為破骨細胞的鬼筆環肽染色（標尺=200 μm）

圖4 破骨細胞的骨吸收活性檢測（標尺=100 μm）

3 討 論

破骨細胞是由單核巨噬細胞融合而成[5]，巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）與RANKL是破骨細胞分化過程中的兩個重要細胞因子[6]。M-CSF與破骨細胞前體細胞上c-fms受體結合促進細胞增殖與細胞骨架的形成[7]；RANKL是促進破骨細胞前體細胞向破骨細胞分化的關鍵細胞因子[8]，RANKL與破骨細胞前體細胞上的RANK受體結合，RANK被激活后關鍵的起始階段是腫瘤壞死因子受體相關的細胞內因子 （tumor necrosis factor, TNF）受體相關因子（receptor-associated factor, TRAF）結合到受體RANK胞內特殊的結構域[9]，最終引起破骨細胞特殊基因的表達并向破骨細胞分化[10]。上述機制的發現使得體外誘導破骨細胞變得相對簡單，現在RANKL與 M-CSF聯合成為誘導破骨細胞的主要方法。

RAW 264.7細胞是小鼠單核巨噬細胞系并可以融合為破骨細胞[11]，且RAW 264.7細胞能表達破骨細胞表型標志物。Xu等[12]研究認為RAW 264.7細胞是晚期分化階段的破骨前體細胞，僅需要RANKL就可以誘導出破骨細胞。但文獻報道用RAW 264.7細胞誘導破骨細胞的方法差異較大，本研究主要探索用RAW 264.7細胞誘導破骨細胞的適宜條件。

RAW 264.7細胞生長迅速，誘導的密度采取密度梯度法直觀摸索條件，發現接種密度為5×103/cm2時4 d后細胞生長狀態良好，多數實驗者根據文獻確定細胞密度，建議誘導前進行密度梯度摸索，同時RAW 264.7細胞的狀態對誘導破骨細胞也至關重要，狀態良好的RAW 264.7細胞更易誘導出破骨細胞。經過高劑量RANKL多次誘導發現，RAW 264.7細胞經誘導24 h后出現少量有融合能力的TRAP陽性細胞，48 h后幾乎所有的RAW 264.7細胞均為TRAP陽性且開始發生融合[13]，并開始出現TRAP陽性的多核破骨細胞，96 h后出現大量的TRAP陽性的破骨細胞。隨后進行RANKL濃度梯度誘導發現20 ng/ml時即出現大量的TRAP陽性細胞，隨著RANKL濃度的增加破骨細胞的數量并無顯著的增加[14]，這可能與RANKL和RAW 264.7細胞上的RANK受體結合達到飽和有關。因此筆者將RAW 264.7細胞以5×103/cm2的密度、20 ng/ml的RANKL濃度誘導4 d作為最佳誘導條件。按此條件誘導4 d后，成熟的破骨細胞經鬼筆環肽熒光染色可見到纖維肌動蛋白環，纖維肌動蛋白環是成熟破骨細胞在骨上形成密閉小室進行骨吸收的重要結構[15]。24孔骨細胞培養板中可以明顯看到破骨細胞吸收留下的瘢痕，這是檢驗破骨細胞功能的直觀指標。最后PCR檢測發現破骨細胞分化過程的相關基因TRAP、OSCAR、c-Fos、NFATc1均高表達。

圖5 RAW 264.7細胞經RANKL誘導48 h后破骨細胞相關基因的表達

綜上所述，采用小鼠單核細胞系RAW 264.7誘導破骨細胞是一種高效簡單的方法，可以為實驗需要提供大量形態與功能良好的破骨細胞。由于實驗條件的不同，誘導前應對細胞接種密度、誘導天數、RANKL的誘導濃度進行摸索，以期提高誘導效率。

[1]Hayashi M, Nakashima T, Taniguchi M, et al. Osteoprotection by semaphorin 3A [J]. Nature, 2012, 485（7396）: 69-74. DOI:10.1038/nature11000 .

[2]Boyle W J, Simonet W S and Lacey D L. Osteoclast differentiation and activation [J]. Nature, 2003, 423（6937）: 337-342. DOI: 10.1038/nature01658 .

[3]Xiong Q, Zhang L, Xin L, et al. Proteomic study of different culture medium serum volume fractions on RANKL-dependent RAW 264.7 cells differentiating into osteoclasts [J]. Proteome Sci, 2015, 13（5）:16. DOI:10.1186/ s12953-015-0073-6.

[4]Fujiwara T, Zhou J, Ye S, et al. RNA-binding protein Musashi2 induced by RANKL is critical for osteoclast survival [J]. Cell Death Dis, 2016, 7（7）:e2300. DOI: 10.1038/cddis.2016.213.

[5]Asagiri M and Takayanagi H. The molecular understanding of osteoclast differentiation [J]. Bone, 2007, 40（ 2）: 251-264. DOI:10.1016/j.bone.2006.09.023.

[6]Miron R J and Bosshardt D D. OsteoMacs: Key players around bone biomaterials [J]. Biomaterials, 2016, 82（3）: 1-19. DOI:10.1016/j.biomaterials.2015.12.017.

[7]Dou C, Li J, Kang F, et al. Dual effect of cyanidin on RANKL-Induced differentiation and fusion of osteoclasts [J]. J Cell Physiol, 2016, 231（ 3）: 558-567. DOI: 10.1002/jcp.24916.

[8]Takeshita S, Namba N, Zhao J J, et al. SHIP-deficient mice are severely osteoporotic due to increased numbers of hyper-resorptive osteoclasts [J]. Nat Med, 2002, 8（ 9）: 943-949. DOI:10.1038/nm752.

[9]Galibert L, Tometsko M E, Anderson D M, et al. The involvement of multiple tumor necrosis factor receptor（TNFR）-associated factors in the signaling mechanisms of receptor activator of NF-kappa B, a member of the TNFR superfamily [J]. J Biol Chem, 1998, 273（ 51）: 34120-34127. DOI:10.1074/jbc.273.51.34120.

[10]Heo D N, Ko W K, Moon H J, et al. Inhibition of osteoclast differentiation by gold nanoparticles functionalized with cyclodextrin curcumin complexes [J]. Acs Nano, 2014, 8（12）: 12049-12062. DOI:10.1021/nn504329u.

[11]Zhao N, Tsuda H, Murofushi T, et al. Chaetocin inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation through reduction of Blimp1 in Raw264.7 cells [J]. Life Sciences, 2015, 143（12）: 1-7. DOI:10.1016/j.lfs.2015.10.027.

[12]Xu J, Wang C, Han R, et al. Evidence of reciprocal regulation between the high extracellular calcium and RANKL signal transduction pathways in RAW cell derived osteoclasts [J]. J Cell Physiol, 2005, 202（ 2）: 554-562. DOI:10.1002/jcp.20159.

[13]Levaot N, Ottolenghi A, Mann M, et al. Osteoclast fusion is initiated by a small subset of RANKL-stimulated monocyte progenitors, which can fuse to RANKL-unstimulated progenitors [J]. Bone, 2015, 79（10）:21-28.DOI: 10.1016/j.bone.2015.05.021. Epub 2015 May 22.

[14]Motiur Rahman M, Takeshita S, Matsuoka K, et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation [J]. Bone, 2015, 81（8）:392-399.DOI:10.1016/ j.bone.2015.08.008. Epub 2015 Aug 8.

[15]Takito J, Otsuka H, Yanagisawa N, et al. Regulation of osteoclast multinucleation by the actin cytoskeleton signaling network [J]. J Cell Physiol, 2015, 230（ 2）: 395-405. DOI:10.1002/jcp.24723.

（2016-12-16收稿2016-02-07修回）

（本文編輯 孫秀明）

Induction conditions of osteoclasts differentiation from mouse macrophage RAW 264.7 cell line

GENG Huan，LIN Chen，and XING Gengyan.
Department of Joint limbs in Orthopedics center, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039 , China
Corresponding author: XING Gengyan, E-mail: xgy7766@263.net

ObjectiveThe study aimed to explore the induction conditions of RAW 264.7 cells differentiation into osteoclasts, with the view to improving the amount and activity of osteoclasts.MethodsThe RAW 264.7 cells were induced with different concentrations of receptor activator of nuclear factor κB ligand (RANKL) for 4 days to differentiate into osteoclasts, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining and phalloidin staining were used to identify the osteoclasts, the Osteo Assay Surface Plate was used to measure the bone resorptive activities of osteoclasts, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expressions of osteoclast phenotypic and functional genes TRAP, osteoclast-associated receptor (OSCAR), c-Fos and nuclear factor of activated T-cells 1 (NFATc1).ResultsRAW 264.7 cells induced by RANKL 4 days, could differentiate into multinucleated cells and a large number of fibrous actin rings formed by TRAP positive 1fibers and fibrous actin ring; Bone resorption pits were found on the surface of bone plate by microscope; RT-PCR detected that high expression of message ribonucleic acid (mRNA) made by the gene messenger of osteoclasts for special function.ConclusionsThe RAW 264.7 cells induced for 4 days can differentiate into a large number of osteoclasts with strong bone resorption activity.

RAW 264.7； osteoclast; tartrate-resistant acid phosphatase；receptor activator of nuclear factor κB ligand

R329

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.03.006

國家自然科學基金（11405185）

100039 北京，武警總醫院骨科中心關節四肢科

邢更彥，E-mail:xgy7766@263.net