1，25-二羥維生素D3對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化調節性T細胞的作用研究〔1〕

王建吳，羅靜，郭琿

(山西醫科大學第二醫院，山西 太原 030001)

1，25-二羥維生素D3對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化調節性T細胞的作用研究〔1〕

王建吳，羅靜，郭琿*

(山西醫科大學第二醫院，山西 太原 030001)

目的：探討1，25-二羥維生素D3[1，25(OH)2D3]對單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎間質纖維化調節性T細胞(Treg)的作用。方法：54 只健康雄性wistar大鼠隨機分為假手術組(A組)、UUO組(B組)、1，25(OH)2D3治療組(C組)。每組于術后第1天、第3天、第7天分批處死6 只，留取腎臟組織。用HE染色觀察腎臟病理變化，采用免疫組織化學染色法測定腎臟人叉頭框蛋白P3(FOXP3)、平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達。結果：與假手術組相比，UUO組FOXP3表達水平顯著降低，α-SMA表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與UUO組相比，1，25(OH)2D3治療組FOXP3表達水平顯著升高，α-SMA表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。結論：調節性T細胞可能參與了腎間質纖維化的發生及發展；1，25(OH)2D3作為免疫調節劑可通過上調調節性T細胞減緩腎臟纖維化的進展。

1，25-二羥維生素D3；腎臟間質纖維化；調節性T細胞

腎間質纖維化是所有慢性腎臟病(CKD)，包括原發性、繼發性腎小球疾病，腎小管間質和血管疾病以及腎移植慢性排斥性病變發展至終末期腎臟病(ESRD)共同的最終結局，病理特點包括細胞外基質增多、炎癥細胞在間質沉積、腎小管擴張或萎縮、細胞凋亡等，其確切的發病機制尚未完全清楚，目前治療效果不理想。炎癥是慢性腎臟疾病的基本病理改變，也是腎纖維化的啟動因素，主要表現為免疫細胞浸潤和分泌炎性介質。調節性T細胞(Treg)是一種免疫細胞，胞質內特異性的表達人叉頭框蛋白P3(FOXP3)轉錄因子[1]，因此FOXP3在一定程度上可反映Treg細胞的水平和活性。多項研究證實，Treg細胞紊亂參與了肝臟及肺臟纖維化的進展[2-4]。Treg細胞是否參與腎臟間質纖維化的發生及發展，國內外研究較少。

1，25-二羥維生素D3是維生素D3的活性形式，通過與特異性維生素D受體(VDR)結合而發揮免疫調節作用[5]。維生素D受體主要存在于T細胞、B細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞中[6]，1，25-二羥維生素D3主要參與耐受性樹突狀細胞成熟、Treg細胞的分化及促進免疫抑制反應的細胞因子的分泌進而抑制反應性T細胞的免疫應答[7]。1，25-二羥維生素D3是否通過上調Treg細胞減緩腎間質纖維化的進展，國內外研究較少。本研究主要探討單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型中Treg細胞的變化及1，25-二羥維生素D3對其的影響，從而闡述1，25-二羥維生素D3是否可通過上調Treg細胞減緩腎間質纖維化的進展。

1 材料與方法

1.1 研究的主要試劑和儀器

叉頭蛋白P3抗體(北京博奧森公司)、抗α-SMA抗體(Abcam公司)、羊抗兔IgG抗體(北京博奧森公司)、辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(北京博奧森公司)、DAB顯色液(北京中杉金橋公司)、1，25(OH)2D3(羅蓋全，上海羅氏公司)、熒光顯微鏡(Nikon公司)。

1.2 研究對象及分組

健康清潔級wistar大鼠54 只，由山西醫科大學動物實驗中心提供，體重為190～210 g，平均(200±10) g。將所有wistar大鼠隨機分成3 組，分別為假手術組(A組)、UUO組(B組)、1，25(OH)2D3治療組(C組)，每組各18 只，三組均于術后第1天、第3天、第7天分批處死6 只，留取手術側的腎組織。

1.3 實驗方法

1.3.1 UUO模型制備

將B組及C組健康雄性wistar大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)經腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術臺上，剪毛并消毒腹部皮膚，行左側恥骨上切口，逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層，暴露并分離左側輸尿管，沿左腎下極尋找到左輸尿管，于中上1/3處用4號線上下結扎兩處，然后從中剪斷輸尿管。A組大鼠輸尿管不予結扎，麻醉及其余手術步驟同UUO模型組。

1.3.2 給藥劑量

C組給予1，25(OH)2D33 ng/100 g，A組及B組給予花生油0.5 mL，均于每日上午灌胃，實驗期間各組正常飲食生活。

1.3.3 組織標本灌注及取材

用濃度為10%水合氯醛經腹腔注射麻醉大鼠后，打開胸腔，將灌注用針經心尖部進入左心室，然后剪開右心耳，迅速推入生理鹽水，心耳處流出無色澄清液體后停止灌注。剪開腹腔，取出手術側腎臟組織。

1.3.4 腎組織形態學觀察

常規石蠟切片，HE染色，觀察腎臟組織改變。

1.3.5 腎臟組織FOXP3蛋白、平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的檢測

取腎組織標本，采用免疫組織化學方法檢測。4 μm厚石蠟切片脫蠟水化后，用體積分數3%過氧化氫溶液處理內源性過氧化氫酶，微波修復(EDTA緩沖液)，3%BSA封閉液封閉40 min，分別滴加FOXP3抗體(稀釋300倍)、抗α-SMA抗體(稀釋200倍)，37 ℃孵化2 h。PBS緩沖液清洗3次，每次5 min，加入二抗(稀釋200倍)，37 ℃孵化30 min，DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照。以FOXP3蛋白在腎小管上皮細胞染成黃色或棕黃色為陽性。采用熒光顯微鏡(200倍)觀察采集圖像。每個切片隨機測定5個視野，應用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件測量每一視野中陽性染色區域的積分光密度值(IOD)與測量區域的面積(Area)，計算平均光密度，平均光密度=IOD/Area，對免疫組織化學染色進行半定量分析。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 腎組織形態學表現

光鏡下觀察，HE染色A組未見明顯異常。B組術后第1天和第3天腎小管輕度擴張，上皮細胞空泡變性，腎間質寬度增加，間質中少量炎癥細胞浸潤；第7天腎小管擴張明顯，上皮細胞出現變性、水腫、甚至壞死，腎間質可見大量炎性細胞浸潤，間質寬度明顯增加，偶見萎縮腎小管，纖維化較明顯，表明UUO模型造模成功。

2.2 各組大鼠腎組織α-SMA、FOXP3表達情況比較

與A組比較，B組腎組織α-SMA表達水平顯著升高，FOXP3表達水平顯著降低，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。B組隨著梗阻時間延長，FOXP3表達水平顯著降低，α-SMA表達水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與B組比較，C組腎組織α-SMA表達水平顯著降低，FOXP3表達水平顯著升高，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)(見表1、表2)。

表1 各組大鼠腎組織中α-SMA表達量

表2 各組大鼠腎組織中FOXP3表達量

3 討 論

慢性腎臟病是各種原因引起的腎臟結構和功能障礙，近年來慢性腎臟病的患病率有明顯上升趨勢，每年達7%以上[8]。腎間質纖維化是各種慢性腎臟疾病進展為終末期腎衰竭的最終共同通路，且腎間質纖維化程度與腎功能減退關系較密切。單側輸尿管梗阻模型是以進行性腎小管間質纖維化為特征的實驗性腎臟病模型，是公認的腎小管間質纖維化模型。在多種細胞因子作用下，腎間質成纖維細胞大量增殖并活化為肌成纖維細胞，表達平滑肌肌動蛋白和細胞外基質(如FN、各型膠原)，導致腎間質纖維化。α-SMA是肌成纖維細胞標志性蛋白[9]。尚無有效方法抑制腎間質纖維化的進展。

研究表明，Treg細胞具有介導自身免疫耐受與維持免疫平衡，對自身反應T淋巴細胞活化和增值起負調控作用。Treg細胞的功能失調與自身免疫性疾病、炎癥反應、急性及慢性傳染性疾病、腫瘤免疫耐受、移植排斥以及過敏性疾病密切相關[10-11]。Claassen等[2]研究揭示，在丙型肝炎病毒造成的肝纖維化中，Treg細胞的數量越多，肝纖維化的程度越輕，提示Treg細胞可抑制肝纖維化的發展。Kotsianidis等[3-4]研究表明，通過上調大鼠Treg細胞，可抑制肺纖維化的進展。我們的研究結果顯示：與假手術組相比，UUO組腎組織FOXP3表達減少，α-SMA表達增加；隨著梗阻時間延長，UUO組內腎組織FOXP3表達減少，α-SMA表達增加，提示腎間質纖維化中存在Treg細胞的紊亂，其減少可能加重腎間質纖維化的進展。

1，25-二羥維生素D3是維生素D3的活性形式，通過與單核細胞，活化的T、B細胞上的維生素D受體特異性結合而發揮免疫調節作用[5-6]。Jeffery等[12]研究證實，1，25-二羥維生素D3可誘導Foxp3高表達。Taal和Brenner[13]證實慢性腎臟病中1，25-二羥維生素D3水平下降，誘導RAS系統激活，進而加重腎臟纖維化。本研究結果顯示：與UUO組相比，1，25-二羥維生素D3治療組腎組織FOXP3表達增加，α-SMA表達減少，提示1，25-二羥維生素D3可通過上調Treg細胞減緩腎間質纖維化的進展，可能機制：誘導樹突狀細胞吲哚胺2，3二氧酶(IDO)的表達來上調Treg細胞的數量增加[14]；誘導Treg細胞表達CTLA-4、IL-10、TGF-β、Foxp3及CTLA-4[15]；促進樹突狀細胞表達趨化因子CCL17和CCL20而抑制歸巢因子CCL22的表達，使Treg細胞招募至病變部位[16]。

綜上所述，在UUO大鼠腎間質纖維化中存在Treg細胞的紊亂，且Treg細胞可能參與腎間質纖維化的發生及發展，1，25-二羥維生素D3可能通過上調Treg細胞減緩腎間質纖維化的進展，但對于1，25-二羥維生素D3通過何種途徑發揮上述作用，還有待進一步研究。

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Effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3on Treg cells in UUO rats with renal interstitial fibrosis

WANG Jianwu，LUO Jing，GUO Hui

(The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective：To explore the effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3on regulatory T cells in unilateral ureteral obstruction(UUO) rats with renal interstitial fibrosis.Methods：Fifty-four Wistar rats were assigned to healthy control group(A group)，UUO group(B group)，and 1，25-dihydroxyvitamin D3treatment group(C group).After surgery for 1 day，3 days and 7 days，6 rats were selected from every group randomly，and killed to get the renal.Renal pathological changes were observed by HE staining.The level of Forkhead Box ProteinP3(Foxp3) protein and alpha smooth muscle-actin (a-SMA) were assayed by immunohistochemistry.Results：Compared with healthy control group，the level of Foxp3 protein was significantly lower，and the expression of a-SMA protein was significantly higher in UUO group (P<0.05).Compared with UUO group，the level of Foxp3 protein was significantly higher，and the expression of a-SMA protein was significantly lower in 1，25-dihydroxyvitamin D3treatment group group (P<0.05).Conclusion：Treg cells may involve in the progress of the renal interstitial fibrosis.As an immunomodulator，1，25-dihydroxyvitamin D3might inhibit the progress of renal interstitial fibrosis through increasing the level of Treg cells.

1，25-dihydroxyvitamin D3；renal interstitial fibrosis；regulatory T cells

1671-8631(2017)03-0213-04

〔1〕本課題為山西省留學人員管理委員會辦公室科研資助項目(課題編號：2013-117)；山西省國際科技合作項目(課題編號：2013081056)

*本文通訊作者：郭琿

R692.2

A

2016-12-17

(本文編輯：張榮梅)

王建吳(1991— )，男，山東省臨清市人，在讀碩士。研究方向：腎臟病學。