六價鉻誘導的肝細胞線粒體依賴性凋亡中VDAC1的作用

周曉昕，張玉靜，肖芳，鐘才高

中南大學湘雅公共衛生學院，長沙 410000

在生態系統中，鉻存在多種價態，其中Cr(Ⅵ)具有生物氧化毒性，在自然界中主要以鉻酸鹽或重鉻酸鹽的形式存在，毒性最強[1]。肝臟是人體內最大的實質性器官，物質代謝是其主要功能。外源化學物經胃腸道吸收，由門靜脈系統進入肝臟，經肝臟代謝后進入體循環，此過程稱為首過消除；同時肝臟內血管網密布，外源化學物無論以何種方式進入人體，都可以通過血液循環進入肝臟。因此肝臟既是重要的解毒器官，也是主要的靶器官。線粒體是幾乎所有哺乳動物細胞漿中都存在的一種半自主細胞器，通過三羧酸循環和氧化磷酸化作用產生ATP為細胞提供能量，同時參與多種物質的代謝與合成，還與細胞凋亡、固有免疫和維持細胞內穩態有關[2]。線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)是由位于線粒體內膜和外膜上多個分子組成的蛋白復合體，主要通過調節氧化磷酸化過程來控制細胞能量代謝，以及通過改變線粒體膜通透性引起細胞死亡[3]。電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)，是真核細胞線粒體外膜上的孔道蛋白，是線粒體外膜物質轉運的通道，也是調控細胞生存與死亡途徑的重要節點[4-5]。VDAC1是VDAC的3種亞型之一，可與細胞內多種蛋白(如BCL-2家族蛋白)相互作用，影響線粒體外膜通透性，釋放線粒體膜間隙中的凋亡相關因子進入胞漿，從而引起細胞凋亡[6]。本研究以肝細胞作為研究對象，初步揭示了VDAC1在Cr(Ⅵ)誘導的線粒體依賴性細胞凋亡中的作用，為進一步的機制探討提供了實驗數據；同時也為防治Cr(Ⅵ)引起的職業損害，促進人群健康提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 細胞、儀器和試劑

L02細胞(中南大學湘雅醫學院實驗中心)；293T細胞(軍事醫學科學院)；DH5α感受態細胞(北京鼎國昌盛生物公司)；9700 型 PCR 擴增儀(美國 ABI 公司)； Q5000 型微量紫外分光光度計(美國 Quawell 公司)；Power Wave XS2 微孔板分光光度計(美國 BioTek 公司)；流式細胞儀(美國 BD 公司)；Mini-ProteanTetra 小型垂直電泳槽及PowerPac HC 型高電流電泳儀(美國 Bio-Rad 公司)；重鉻酸鉀(美國Sigma-Aldrich公司)；Hyclone RPMI Medium Modified 培養基、Hyclone DMEM/HIGH GLUCOSE培養基(北京賽默飛世爾生物公司)；胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)；青-鏈霉素(北京LEAGENE公司)；0.25%胰蛋白酶、Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit細胞凋亡檢測試劑盒(美國Genview公司)；嘌呤霉素(美國Invitrogen公司)；二甲基亞砜(美國 Sigma-Aldrich 公司)；Ampicillin sodium salt (BIOSHARP公司)；無內毒素質粒小提試劑盒(北京康為世紀公司)；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒、RIPA裂解液、活性氧(ROS)檢測試劑盒(上海Beyotime生物技術公司)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(北京鼎國昌盛生物公司)；Cell Counting Kit細胞增殖與毒性檢測試劑盒(七海生物公司)；細胞總RNA提取試劑(美國Invitrogen公司)；PrimeScriptTMRT Reagent kit、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(日本Takara公司)；活體細胞線粒體膜通道孔(MPTP)熒光檢測試劑盒(美國GENMED公司)。

1.2 方法

1.2.1 VDAC1穩定低表達細胞系的建立

構建能夠穩定敲低VDAC1基因的shRNA慢病毒載體，在293T細胞中轉染shRNA慢病毒包裝體系，并感染L02細胞獲得VDAC1低表達的L02細胞系，同時轉染空載質粒作為陰性對照(NC)。為避免脫靶效應影響實驗結果，設計2種引物進行細胞轉染，VDAC1低表達shRNA載體引物設計如表1。

1.2.2 L02細胞與VDAC1穩定低表達L02細胞系的培養

L02細胞使用含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI Medium Modified 培養基；VDAC1穩定低表達的L02細胞系及NC細胞使用含有15%胎牛血清、1%青-鏈霉素和0.5%嘌呤霉素的RPMI Medium Modified 培養基。所有細胞在37 ℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養，2～3 d傳代一次，取生長狀態良好的對數期細胞用胰酶消化后按適當的密度接種至新培養皿中，并設置分組，以便用于后續實驗。

1.2.3 預實驗

取處于對數期生長狀態良好的L02細胞、shVDAC1-1、shVDAC1-2及NC細胞，通過胰酶消化后用培養基重懸制成單個細胞懸液，使用細胞計數板計數并調整細胞濃度至1×105cells·mL-1，將細胞接種于96孔板中，每孔100 μL；培養24 h后每孔加入11 μL Cr(Ⅵ)染毒液，使其染毒終濃度分別為2 μmol·L-1、4 μmol·L-1、8 μmol·L-1、16 μmol·L-1、25 μmol·L-1、40 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1，空白對照使用等體積的PBS，每組設3個復孔；染毒24 h后，每孔加入10 μL的CCK8溶液，繼續在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養40 min，使用酶標儀測定450 nm處的吸光值。

1.2.4 細胞的分組與處理

將處于對數生長期狀態良好的L02細胞、shVDAC1-1、shVDAC-2及NC細胞用胰酶消化，按適當濃度接種至新的培養皿，待細胞生長密度達到70%左右時，根據預實驗的結果對細胞進行染毒處理，染毒時間為24 h。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

原理：在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質雙分子層內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的PS由內側翻向外側。Annexin V與PS具有高度親和力，故可通過細胞膜外側暴露的PS與早期凋亡細胞結合，將Annexin V進行熒光素FITC標記，以標記了的Annexin V作為熒光探針，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶(propidium iodide, PI)是一種核酸染料，它不能通過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能透過細胞膜將細胞核染紅。因此將Annexin V與PI結合使用可以區分不同凋亡時期的細胞。

操作步驟：使用胰酶消化1.2.4中處理后的細胞，同時離心收集上清液中的死亡細胞，用PBS洗滌2次后加入300 μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI混勻，室溫避光反應5～10 min，1 h內進行流式細胞儀分析。

1.2.6 ROS活性檢測

原理：DCFH-DA本身無熒光，可自由穿過細胞膜，進入細胞后可被細胞內的酯酶水解為不能通過細胞膜的DCFH。細胞內的活性氧可將無熒光的DCFH氧化為有熒光的DCF，檢測熒光強度即可判斷細胞內活性氧的含量。

操作步驟：將受試細胞按適當密度接種至6孔板，按1.2.4中步驟分組處理，24 h后除去細胞培養液，PBS清洗3～4次，用無血清培養基按1∶1 200稀釋DCFH-DA，每孔加入300 μL，37 ℃細胞培養箱孵育20 min，每隔3～5 min混勻一次，無血清培養基清洗細胞3次，收集細胞，通過流式細胞儀檢測ROS活性。

1.2.7 MPTP孔開放度測定

原理：鈣黃綠素-AM極易進入細胞及線粒體，當它進入細胞后被酯酶切離，形成熒光性強的鈣黃綠素，鈣黃綠素進入線粒體后即被線粒體俘獲，而未進入線粒體的鈣黃綠素被胞漿中的淬滅劑鈷離子淬滅，失去熒光。當MPTP孔開放，線粒體中的鈣黃綠素進入胞漿，被鈷離子淬滅。因此檢測細胞熒光強度的變化可判斷MPTP孔道的開放情況。

表1 VDAC1的引物Table 1 Primers for VDAC1

操作步驟：將受試細胞按適當密度接種至96孔板，按1.2.4中步驟進行處理，每種細胞每個處理組設3個復孔；24 h后小心吸盡培養液，沿孔壁在每一個孔中緩緩加入100 μL、37 ℃預熱的清理液，覆蓋細胞，再小心抽去清理液；沿孔壁在每孔中加入100 μL預先配好的含有染色液和中和液的染色工作液，覆蓋細胞表面，置于37 ℃細胞培養箱中孵育20 min，避免光照；小心抽去染色工作液，沿孔壁加入100 μL清理液，清洗2次后再加入100 μL清理液到培養孔中，使用熒光分光光度計進行定量檢測。

1.2.8 蛋白免疫印跡法檢測相關蛋白的表達情況

將受試細胞按1.2.4處理后收集細胞，使用RIPA裂解液和胞漿蛋白抽提試劑分別提取總蛋白和胞漿蛋白，通過蛋白免疫印跡法獲得VDAC1、細胞色素C和AIF的表達水平，以β-肌動蛋白(β-actin)作為內參，獲得上述蛋白在不同細胞及不同處理組中的變化情況。

1.3 統計學分析

2 結果(Results)

2.1 L02-VDAC1低表達細胞系的鑒定

用Western blot法檢驗細胞系，如圖1所示，轉染細胞shVDAC1-1和shVDAC1-2中VDAC1的表達較L02明顯減少；而NC細胞 VDAC1的表達與L02相比無明顯差異。

圖1 Western blot法檢測4種細胞內VDAC1的表達Fig. 1 The Western blot bands of VDAC1 expression in 4 types of cells

2.2 VDAC1低表達對Cr(Ⅵ)處理的細胞生存率的影響

不同濃度Cr(Ⅵ)對4種細胞生存率的影響見圖2，實驗結果表明隨著Cr(Ⅵ)染毒濃度的增加，4種細胞的生存率均有下降(P<0.05)，并呈現明顯的劑量-反應關系；但VDAC1低表達組較L02和NC細胞下降趨勢較為平緩；根據CCK-8實驗結果，確保Cr(Ⅵ)處理后細胞生存率在一個比較適合的范圍(>70%)，故選擇8 μmol·L-1為后續試驗的處理濃度；且在染毒濃度為8 μmol·L-1時，L02與NC細胞的生存率與非染毒組相比均下降(P<0.05)，而VDAC1低表達細胞的生存率與非染毒組相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導的細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，如圖3和圖4所示，Q4為正常細胞，Q3為早期凋亡細胞，Q2為晚期凋亡細胞，Q1為壞死細胞，本實驗主要研究晚期凋亡。VDAC1未敲低的L02細胞與NC細胞經Cr(Ⅵ)染毒處理后凋亡率升高(P<0.05)，而VDAC1低表達組細胞染毒組與非染毒組的凋亡率無明顯差異。

圖2 不同濃度的Cr(Ⅵ)對受試細胞生存率的影響Fig. 2 Different doses of Cr(Ⅵ) exposure on hepatocytes viability

細胞類型Celltype對照組Controlgroup8μmol·L-1Cr(Ⅵ)處理組8μmol·L-1Cr(Ⅵ)groupL0210.79±0.04*NC10.80±0.08*shVDAC1-110.88±0.12shVDAC1-210.84±0.10

注：與同類型細胞對照組比較，*P<0.05。

Note: P<0.05 compared to the control group.

圖3 Cr(Ⅵ)暴露對不同細胞凋亡率的影響Fig. 3 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ) exposure-induced apoptosis in 4 types of cell

圖4 Cr(Ⅵ)暴露對不同細胞凋亡率的影響注：與同類型細胞對照組相比* P<0.05。Fig. 4 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ) exposure-induced apoptosis in 4 types of cellNotes: * P<0.05 compared with the control group.

2.4 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導的細胞內ROS的影響

本實驗使用DCFH-DA探針通過流式細胞儀檢測細胞內ROS的生成，如圖5所示，經Cr(Ⅵ)染毒處理后，L02細胞與NC細胞內ROS含量明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05)；而VDAC1低表達組2種細胞ROS的生成量增加不明顯，與非染毒組相比無統計學差異。

2.5 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導的線粒體功能的影響

2.5.1 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導的L02肝細胞MPTP活性的影響

使用鈣黃素-AM熒光探針檢測MPTP孔活性，經Cr(Ⅵ)處理后測得熒光強度減弱，說明MPTP孔活性增強。計算非染毒組與染毒組熒光強度的比值，得出相對熒光強度，相對熒光強度值大，說明染毒后細胞熒光強度減弱程度大，提示MPTP活性增強。比較4種細胞經Cr(Ⅵ)染毒后MPTP開放程度，如圖6所示，經Cr(Ⅵ)染毒后，測得L02細胞和NC細胞的相對熒光強度高于VDAC1低表達組細胞，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明L02細胞與NC細胞染毒后熒光強度明顯減弱，細胞內MPTP活性增強；而VDAC1低表達組的相對熒光強度約為1，表明染毒后VDAC1低表達組細胞的MPTP活性無明顯變化。

圖5 VDAC1對Cr(Ⅵ)引發產生細胞ROS的影響注：與同類型細胞對照組相比* P<0.05。Fig. 5 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ) induced ROS accumulation in hepatocytesNote: * P<0.05 compared with the control group.

2.5.2 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導的肝細胞內細胞色素C表達的影響

用Western blot法檢測4種細胞胞漿內細胞色素C的表達情況，Image J進行灰度值分析。結果如圖7和表3所示。與非染毒組相比，L02細胞與NC細胞經8 μmol·L-1Cr(Ⅵ)染毒后胞漿內細胞素色C的含量顯著上升，差異具有統計學意義(P<0.05)；VDAC1低表達的2組細胞，經Cr(Ⅵ)處理后胞漿內細胞素色C的含量變化不明顯。

圖6 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導的肝細胞MPTP活性的影響注：與同類型細胞對照組相比* P<0.05。Fig. 6 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ)-induced MPTP activity change in hepatocytesNote: *P<0.05 compared with the L02 group.

圖7 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導的肝細胞胞漿中Cyt C表達的影響的蛋白免疫印跡圖Fig. 7 The Western blot bands of the effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ)-induced Cyt C expression in cytoplasm

圖8 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導的肝細胞胞漿中AIF表達的影響Fig. 8 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ)-induced AIF expression in cytoplasm

2.6 VDAC1對Cr(Ⅵ)染毒引起的AIF變化的影響

Western blot法檢測胞漿內AIF的含量，結果如圖8所示，經Cr(Ⅵ)染毒后，L02細胞與NC細胞胞漿內AIF含量明顯升高，差異具有統計學意義(見表4)(P<0.05)；VDAC1低表達組的細胞經Cr(Ⅵ)處理后胞漿內AIF的變化并不明顯。

3 討論(Discussion)

鉻是一種具有多種價態的重金屬，其中以六價鉻的形式最為常見。Cr(Ⅵ)在工業上的應用極為廣泛，涉及不銹鋼制造、制革、電鍍、焊接和木材加工等多個領域[7-8]。Cr(Ⅵ)暴露會使人體產生急慢性中毒，引起支氣管炎癥，造成肝腎損傷，胃腸道潰瘍，同時Cr(Ⅵ)也具有遺傳毒性及致癌性[9]。Bagchi等[10]認為Cr(Ⅵ)可使得細胞內ROS生成量和脂質過氧化增加，導致DNA碎片化以及細胞凋亡。本實驗室前期研究結果表明，Cr(Ⅵ)可以影響L02細胞的生存率，引起細胞凋亡，并證實Cr(Ⅵ)引起的細胞毒性和凋亡與線粒體功能損傷有關[11]。MPTP是位于線粒體內膜上可以改變線粒體通透性的孔道[12]，早在1990年Crompton和Costi[13]就發現線粒體通透性改變是細胞死亡的關鍵調控因素，隨后的一些研究結果表明，ROS可以使線粒體通透性增加[14]。Le-Quoc K和Le-Quoc D[15]發現，要引起線粒體通透性變化需要線粒體外膜與內膜同時改變，而線粒體內膜外膜上有一些特定區域可作為它們相互作用的接觸位點，VDAC就是位于線粒體外膜上的連接內膜與細胞質的位點[16]。VDAC1是VDAC 的3種亞型之一，它可調控線粒體外膜通透性，同時控制線粒體膜內外的物質運輸[17]。本研究以L02細胞建立VDAC1低表達細胞系，通過將L02細胞、NC細胞與VDAC1低表達細胞作為研究對象，以預實驗結果選定染毒濃度，建立鉻肝細胞毒性損傷模型。結果顯示，隨著Cr(Ⅵ)染毒濃度的增加，4種細胞的生存率均存在不同程度的下降，且兩者存在劑量-反應關系，但VDAC1低表達的2組細胞下降趨勢較平緩；選定8 μmol·L-1為后續染毒劑量，在此劑量組中，L02與NC細胞的生存率與非染毒組相比均有下降且具有統計學差異(P<0.05)，但VDAC1低表達組的生存率與非染毒組相比無明顯差異；同時細胞凋亡情況的結果與生存率相符，Cr(Ⅵ)染毒組L02與NC細胞的凋亡率與非染毒組相比明顯上升(P<0.05)，而VDAC1低表達細胞染毒組與非染毒組的凋亡情況無明顯差異。此外，本課題組前期實驗數據顯示Cr(Ⅵ)染毒24 h后，L02細胞內ROS的含量顯著上升[18]，與上文中L02與NC組的實驗數據一致，但VDAC1低表達組染毒前后細胞內ROS生成量未見明顯上升。因此，以上實驗結果提示Cr(Ⅵ)染毒條件下，VDAC1敲低確實可以降低細胞內ROS生成量從而減少細胞凋亡，提高細胞生存率。

表3 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導的肝細胞胞漿中Cyt C表達的影響Table 3 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ)-induced Cyt C expression in cytoplasm

注：與同類型細胞對照組比較，*P<0.05。

Note:*P<0.05 compared to the control group.

表4 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導的肝細胞胞漿中AIF表達的影響Table 4 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ)-induced AIF expression in cytoplasm

注：與同類型細胞對照組比較，*P<0.05。

Note:*P<0.05 compared to the control group.

為進一步闡明VDAC1影響Cr(Ⅵ)誘導的肝細胞凋亡的原因，本研究檢測了Cr(Ⅵ)處理后4種細胞線粒體功能及凋亡相關蛋白的變化情況。與非染毒組相比，L02和NC細胞染毒后MPTP活性增強(P<0.05)，同時胞漿內細胞色素C的含量明顯增加(P<0.05)，表明在Cr(Ⅵ)的作用下，線粒體通透性轉換孔的開放性增加，線粒體內的細胞色素C進入胞漿中，提示上述2種細胞發生了線粒體功能障礙；而VDAC1低表達組細胞的MPTP活性與胞漿內細胞色素C含量均無明顯增加。同時L02細胞與NC細胞在染毒后，胞漿內AIF含量增加，與非染毒組相比有明顯差異(P<0.05)，VDAC1低表達組的2種細胞胞漿內AIF的含量無明顯差異，說明VDAC1敲低可以拮抗由Cr(Ⅵ)誘導的肝細胞凋亡。

綜上所述，Cr(Ⅵ)可使肝細胞中ROS生成量增加，造成線粒體功能障礙，線粒體外膜通透性增加，使得線粒體內的凋亡相關蛋白漏出，進入胞漿，引起細胞凋亡；而降低VDAC1的表達可抑制由Cr(Ⅵ)誘導的肝細胞凋亡。本研究可為Cr(Ⅵ)影響肝細胞線粒體依賴性凋亡的分子機制研究提供部分證據，從而為搞清楚鉻暴露所致肝細胞毒性與肝損傷的預防和控制提供思路。但本研究還需在分子機制與信號通路方向進行進一步研究，并在后期通過動物實驗驗證。

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