高甾醇含量熱帶假絲酵母細胞的培養(yǎng)條件研究

趙國群，劉紅彥，劉金龍

(1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術研究中心，河北石家莊050018）

高甾醇含量熱帶假絲酵母細胞的培養(yǎng)條件研究

趙國群1,2，劉紅彥1，劉金龍1,2

(1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術研究中心，河北石家莊050018）

以大豆油脫臭餾出物為唯一碳源，研究了高產(chǎn)甾醇的熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）1253細胞的培養(yǎng)條件。研究發(fā)現(xiàn)，無機氮源培養(yǎng)使得菌體甾醇含量顯著高于有機氮源培養(yǎng)。當尿素與牛肉膏復合作為氮源時，菌體甾醇含量最高（7.55%）。最佳培養(yǎng)基配方為：脫臭餾出物50.0 g/L、尿素1.0 g/L、牛肉膏1.0 g/L、甘氨酸0.02 g/L、十二烷基苯磺酸鈉0.5 g/L、MgSO40.1 g/L、K2HPO40.2 g/L、KH2PO40.2 g/L。最適培養(yǎng)條件為：初始pH7.0、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。采用上述最適的發(fā)酵條件，按10%（V/V）接種量接入熱帶假絲酵母1253種子液，30℃搖床振蕩培養(yǎng)96 h。發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)過測定，酵母細胞中甾醇含量為8.83%。

甾醇；熱帶假絲酵母；培養(yǎng)；大豆油脫臭餾出物

甾醇是廣泛存在于動物、植物、微生物組織中的一類甾族化合物，是以環(huán)戊烷全氫菲為骨架（又稱甾核）帶有4個環(huán)的高碳環(huán)形一元仲醇。甾醇在動物組織中以膽甾醇（又稱膽固醇）為主；在植物組織中，主要是β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇[1]；而在微生物細胞中，主要是麥角甾醇、膽甾醇和豆甾醇[2]。甾醇對生物體有著重要的生理功能，同時對人體還具有多種生理功能。β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、延緩衰老等作用，對人體無毒副作用，被科學家們譽為生命的鑰匙，廣泛于應用食品、醫(yī)藥及化妝品[3]。麥角甾醇是合成維生素D2的前體和生產(chǎn)可的松、黃體酮、蕓苔素內(nèi)酯和抗癌藥物等甾醇類藥物的重要原料[4]。甾醇也可作為生產(chǎn)甾類激素藥物的中間體如雄甾-4-烯-3,17-二酮的原料[5]。酵母菌發(fā)酵法是國內(nèi)外麥角甾醇生產(chǎn)的主要方法。由于用微生物來生產(chǎn)所需要甾體原料的成本遠遠低于植物，而且微生物生長迅速、容易進行工業(yè)化生產(chǎn)，因此從微生物中提取甾醇具有許多優(yōu)勢。然而，微生物細胞中的甾醇含量都很低，如酵母菌的甾醇含量一般為0.03%～4.60%[6]。如何獲得高產(chǎn)甾醇的細胞是多年來一直困擾甾醇工業(yè)發(fā)展的難題之一。

采用熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）1253發(fā)酵大豆油脫臭餾出物（主要成分游離脂肪酸），在實現(xiàn)濃縮脫臭餾出物中植物甾醇的同時，發(fā)現(xiàn)所收獲的酵母細胞含有豐富的甾醇，其總甾醇含量達到6.96%（干質(zhì)量），并研究證明酵母細胞高產(chǎn)甾醇是由于使用脂肪酸做碳源[7]。在此研究結(jié)果的基礎上，本研究以大豆油脫臭餾出物為唯一碳源，研究了氮源、無機鹽、生長因子、乳化劑、pH值、搖床轉(zhuǎn)速對熱帶假絲酵母1253細胞合成甾醇的影響，以期進一步提高酵母細胞中甾醇含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

大豆油脫臭餾出物（簡稱脫臭餾出物）（游離脂肪酸含量66.13%）：石家莊益海糧油有限公司提供；熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）1253：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；蛋白胨、酵母粉、牛肉膏：北京奧博星生物技術有限責任公司；維生素H、葉酸、肌醇、賴氨酸、組氨酸、丙氨酸、甘氨酸：北京索萊寶科技有限公司；吐溫20、吐溫80、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）400：天津市永大化學試劑有限公司；十二烷基苯磺酸鈉（sodium dodecyl benzene sulfonate，SDBS）、司盤80：天津市博迪化工有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，K2HPO42.0 g/L；用NaOH調(diào)pH至7.2，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：脫臭餾出物50.0 g/L，尿素1.0 g/L，MgSO40.1 g/L，K2HPO40.2 g/L，KH2PO40.2 g/L；用NaOH調(diào)pH至7.0，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LG16-B型高速離心機：北京雷勃爾設備有限公司；752紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；SPX-250B-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：上海賀德實驗設備有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液的制備

將2～3環(huán)斜面培養(yǎng)物接種至裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h。

1.3.2 脫臭餾出物的發(fā)酵

將熱帶假絲酵母1253種子液以10%（V/V）的接種量接種到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于30℃、200 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)96 h。

1.3.3 氮源對菌體甾醇含量的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源分別調(diào)整為：酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、尿素、硫酸銨和氯化銨，其含量均為1.0 g/L。接入10%（V/V）熱帶假絲酵母1253種子液后，30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)96h。為了進一步考察復合氮源的影響，將1.0g/L尿素分別與1.0 g/L的酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨和氯化銨組合成復合氮源，并以尿素為對照。

1.3.4 無機鹽對菌體甾醇含量的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基的成分調(diào)整為：脫臭餾出物50.0 g/L、酵母粉1.0 g/L，K2HPO40.2 g/L、KH2PO40.2 g/L，并分別添加0.1 g/L硫酸鎂、0.01 g/L硫酸亞鐵、0.05 g/L硫酸鋅、0.02 g/L氯化錳和0.1 g/L氯化鈣，將沒有添加上述無機鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基設為對照。上述培養(yǎng)基以10%（V/V）接種熱帶假絲酵母1253后，30℃、200 r/min搖床發(fā)酵96 h。

1.3.5 生長因子對菌體甾醇含量的影響

分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.02 g/L的維生素H、葉酸、肌醇、組氨酸、賴氨酸、丙氨酸、甘氨酸。按10%接種量接種熱帶假絲酵母1253后，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)96 h。以沒有添加生長因子的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，以便考察上述生長因子對酵母細胞甾醇合成的影響。

1.3.6 表面活性劑對菌體甾醇含量的影響

分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5 g/L的吐溫20、吐溫80、十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、聚乙二醇（PEG）400、司盤80、聚乙烯醇（PVA），并以沒有添加表面活性劑的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。按10%接種量接入熱帶假絲酵母1253種子液，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)96 h。

1.3.7 初始pH對菌體甾醇含量的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH依次調(diào)節(jié)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，然后以10%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上。30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)96 h。

1.3.8 搖床轉(zhuǎn)速對菌體甾醇含量的影響

將熱帶假絲酵母1253以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，搖床轉(zhuǎn)速分別設定為160r/min、180r/min、200r/min、220 r/min、240 r/min，30℃搖床振蕩培養(yǎng)96 h。

1.3.9 酵母細胞中總甾醇含量的測定

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液放置于離心機中5 000 r/min離心10 min，棄去上層油脂及清液，獲得細胞泥即熱帶假絲酵母菌體。將所得菌體用溫水洗滌3次，在80℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，然后采用磷硫鐵法[8-9]（以豆甾醇計）測定菌體中總甾醇的含量。精確稱取0.1 g干菌體于25 mL比色管中，用無水乙醇定容至25 mL，按照1∶1∶2的體積比分別加入樣品、無水乙醇和磷硫鐵顯色劑，充分振蕩后在室溫下顯色15 min，在波長520 nm條件下用紫外可見光分光光度計測其吸光度值。菌體中總甾醇含量計算公式如下：

式中：w為菌體中總甾醇含量，%；c為樣品吸光度值在標準曲線上相對應的甾醇質(zhì)量濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；B為稀釋倍數(shù)；m為稱取的菌體質(zhì)量，μg。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源對菌體甾醇含量的影響

氮源是微生物生長及代謝產(chǎn)物合成最重要的營養(yǎng)成分之一。為了確定熱帶假絲酵母1253以大豆油脫臭餾出物為碳源合成甾醇的適宜氮源，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別使用了6種單一氮源，試驗結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，氮源的種類對熱帶假絲酵母1253細胞甾醇的生物合成有很大影響。無機氮源使得酵母細胞產(chǎn)生甾醇的量要顯著高于有機氮源，尤其是當尿素為氮源時，酵母細胞中甾醇含量最高，達到了6.76%。胡弢等[10]研究微生物發(fā)酵法預處理脫臭餾出物時，發(fā)現(xiàn)以尿素為氮源時，熱帶假絲酵母1253生長得最好。上述試驗結(jié)果表明，當脫臭餾出物為唯一發(fā)酵底物時，尿素既可促進菌體生長，又可促進細胞中甾醇的合成。然而，SHANG F等[11]發(fā)現(xiàn)尿素作氮源時，雖然可明顯增加釀酒酵母細胞中麥角甾醇的含量，但會抑制菌體的生長。造成這種研究結(jié)果差異的原因可能與所使用的酵母菌種和碳源的不同有關。過多游離甾醇對細胞是有害的，當細胞膜上游離甾醇含量過多（≥3.0%）時，部分甾醇便會與脂肪酸發(fā)生酯化反應，生產(chǎn)甾醇脂肪酸酯，并儲存于脂質(zhì)微粒中[12]。由此推斷，以脫臭餾出物為唯一碳源，熱帶假絲酵母細胞所合成的甾醇應主要是甾醇酯。

圖1 單一氮源對菌體甾醇含量的影響Fig.1 Effect of single nitrogen sources on sterol content in cells

為了進一步優(yōu)化培養(yǎng)基的氮源，將尿素與分別所試驗的其他6種氮源組合成復合氮源，試驗結(jié)果見圖2。如圖2所示，與尿素單獨做氮源相比，硫酸銨+尿素、酵母粉+尿素、氯化銨+尿素、蛋白胨+尿素均使得熱帶假絲酵母細胞中甾醇含量降低，這個結(jié)果表明，當培養(yǎng)基含有尿素時，硫酸銨、氯化銨、酵母粉、蛋白胨對細胞甾醇的生物合成有抑制作用，其機理尚不清楚。只有尿素與牛肉膏復合做氮源時，菌體中甾醇含量顯著增加，達到了7.55%。因此，熱帶假絲酵母1253發(fā)酵脫臭餾出物的適宜復合氮源是尿素1.0g/L、牛肉膏1.0 g/L。

圖2 復合氮源對菌體甾醇含量的影響Fig.2 Effect of co-nitrogen sources on sterol content in cells

2.2 無機鹽對菌體甾醇含量的影響

6種無機鹽對熱帶假絲酵母1253菌體中甾醇含量的影響見圖3。

圖3 無機鹽對菌體甾醇含量的影響Fig.3 Effect of mineral salts on sterol content in cells

如圖3所示，培養(yǎng)基中無機鹽的種類對酵母細胞中甾醇的合成有非常大的影響。同沒有添加無機鹽的對照相比，硫酸亞鐵、氯化鈣和氯化錳均對細胞甾醇的生物合成有很大抑制，使得菌體甾醇含量大幅度降低。然而，硫酸鋅、硝酸鉀和硫酸鎂卻表現(xiàn)出了顯著的刺激細胞合成甾醇的作用，其中硫酸鎂的刺激作用最大。研究表明，Mg2+參與酵母細胞生長及代謝的調(diào)節(jié)，Mg2+的缺乏影響酵母細胞的生長[13]。從麥角甾醇的合成途徑分析，Mg2+是甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸磷酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶的激活劑，因而Mg2+的加入促進麥角甾醇的合成[14]。

2.3 生長因子對菌體甾醇含量的影響

為了考察生長因子對菌體甾醇含量的影響，分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入維生素H、葉酸、肌醇、組氨酸、賴氨酸、丙氨酸、甘氨酸，試驗結(jié)果見圖4。

圖4 生長因子對菌體甾醇含量的影響Fig.4 Effect of growth factors on sterol content in cells

從圖4可以發(fā)現(xiàn)，與沒有添加任何生長因子的對照相比，添加葉酸、肌醇、賴氨酸和丙氨酸使得菌體甾醇含量明顯降低，這表明這些生長因子均抑制細胞內(nèi)甾醇的生物合成，其中肌醇的抑制作用最大。添加組氨酸對菌體甾醇含量幾乎沒有影響。然而，添加維生素H和甘氨酸卻能顯著促進細胞中甾醇的合成，特別是甘氨酸，使得菌體甾醇含量提高了7.03%，但其促進酵母細胞合成甾醇的機理目前尚不清楚。

2.4 表面活性劑對菌體甾醇含量的影響

大豆油脫臭餾出物不溶于水，因而漂浮在培養(yǎng)基的表面，形成油水兩相。添加表面活性劑有助于油水兩相混合，增大菌體與脫臭餾出物的接觸面，從而有利于菌體對發(fā)酵底物的吸收與利用。添加表面活性劑對酵母細胞合成甾醇的影響見圖5。

如圖5所示，與沒有添加表面活性劑的相比，吐溫20、十二烷基苯磺酸鈉、聚乙二醇400和聚乙烯醇均使得菌體甾醇含量提高，其中SDBS的效果最好，使得菌體甾醇含量達到了8.57%。添加吐溫80對菌體甾醇含量幾乎沒有影響，而司盤80對菌體甾醇的合成稍有抑制作用。

2.5 初始pH對菌體甾醇含量的影響

為了研究培養(yǎng)基的初始pH對熱帶假絲酵母1253合成甾醇的影響，將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)節(jié)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，試驗結(jié)果見圖6。

圖6 初始pH對菌體甾醇含量的影響Fig.6 Effect of initial pH on sterol content in cells

從圖6可以看出，培養(yǎng)基的初始pH為4.0～7.0時，隨著培養(yǎng)基初始pH的增加，酵母細胞甾醇含量逐漸增加；當初始pH為7.0時，菌體含量達到最大值（6.95%），這說明熱帶假絲酵母1253適合在中性條件下合成甾醇。當初始pH為7.0～ 9.0時，隨著pH的升高，菌體甾醇含量則快速下降。因此，培養(yǎng)基適宜的初始pH值為7.0。

2.6 搖床轉(zhuǎn)速對菌體甾醇含量的影響

搖床轉(zhuǎn)速的高低直接影響培養(yǎng)基中溶氧的多少，搖床轉(zhuǎn)速對菌體甾醇含量的影響見圖7。

圖7 搖床轉(zhuǎn)速對菌體甾醇含量的影響Fig.7 Effect of shaker speed on sterol content in cells

從圖7可以看出，當搖床轉(zhuǎn)速為160～200 r/min時，隨著轉(zhuǎn)速的提高，菌體甾醇含量由4.81%增加至6.85%。當搖床轉(zhuǎn)速超過200r/min時，菌體甾醇含量幾乎不再增加。有研究表明，麥角甾醇的合成具有需氧代謝的特征，酵母對溶氧的要求較高，通氣量增大可明顯提高生物量，同時也有利于麥角甾醇的積累[15]。這與本研究的試驗結(jié)果一致，因此，適宜的搖床轉(zhuǎn)速為200r/min。

2.7 驗證試驗

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，熱帶假絲酵母1253的最適培養(yǎng)基為脫臭餾出物50.0g/L，尿素1.0g/L，牛肉膏1.0g/L，甘氨酸0.02 g/L，SDBS 0.5 g/L，MgSO40.1 g/L，K2HPO40.2 g/L，KH2PO40.2g/L，初始pH值7.0。適宜的搖床轉(zhuǎn)速為200r/min。采用上述最適的發(fā)酵條件，按10%（V/V）接種量接入熱帶假絲酵母1253種子液，30℃搖床振蕩培養(yǎng)96 h。發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)過測定，酵母細胞中甾醇含量為8.83%。

3 結(jié)論

以大豆油脫臭餾出物為唯一碳源，研究了高甾醇含量熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）1253細胞的培養(yǎng)條件。研究發(fā)現(xiàn)，無機氮源使得菌體甾醇含量顯著高于有機氮源。當尿素與牛肉膏復合做氮源時，菌體中甾醇含量最高，達到了7.55%。硫酸亞鐵、氯化鈣和氯化錳均對甾醇生物合成有很大抑制，使得菌體甾醇含量大幅度降低；而硫酸鋅、硝酸鉀和硫酸鎂卻表現(xiàn)出了顯著的刺激細胞合成甾醇的作用，其中硫酸鎂的刺激作用最大。葉酸、肌醇、賴氨酸和丙氨酸使得菌體甾醇含量明顯降低，而維生素H和甘氨酸卻能顯著促進細胞中甾醇的合成，特別是甘氨酸，使得菌體甾醇含量提高了7.03%。與沒有添加表面活性劑的相比，吐溫20、十二烷基苯磺酸鈉、聚乙二醇400和聚乙烯醇使得菌體甾醇含量顯著提高，其中十二烷基苯磺酸鈉的效果最好，使得菌體甾醇含量達到8.57%。適宜的培養(yǎng)基初始pH值為7.0。適宜的搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。甾醇的產(chǎn)量除與菌體甾醇含量有關外，還與菌體生物量有關，因此，熱帶假絲酵母1253以大豆油脫臭餾出物為唯一碳源高產(chǎn)甾醇的發(fā)酵工藝還需進一步優(yōu)化和改進。

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Cultivation conditions of yeast cells ofCandida tropicaliswith higher sterols yield

ZHAO Guoqun1,2,LIU Hongyan1,LIU Jinlong1,2
(1.College of Bioscience and Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China; 2.Fermentation Engineering Center of Hebei Province,Shijiazhuang 050018,China)

In this study,the cultivation conditions of yeast cells ofCandida tropicalis1253 with higher sterols yield were investigated using soybean oil deodorizer distillate as single carbon source.The results showed that inorganic nitrogen sources made the cells produce more sterols than organic nitrogen sources.When urea and beef extract were used as co-nitrogen source,the yeast cells had the highest sterol content(7.55%).The optimal composition of the cultural medium was as follow：soybean oil deodorizer distillate 50.0 g/L,urea 1.0 g/L,beef extract 1.0 g/L,glycine 0.02 g/L, SDBS 0.5 g/L,MgSO40.1 g/L,K2HPO40.2 g/L,KH2PO40.2 g/L.The optimal cultivation conditions were initial pH of medium 7.0 and shaker speed 200 r/min.Using the optimal fermentation conditions above,C.tropicalis1253 was cultivated with 10%inoculum size in a shaker at 30℃for 96 h, and the sterol content in the yeast cells obtained was 8.83%.

sterols;Candida tropicalis;cultivation;soybean oil deodorizer distillate

TS202.3

0254-5071（2017）02-0049-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.011

2016-10-05

河北省自然科學基金項目（C2015208049）

趙國群（1963-），男，教授，博士，研究方向工業(yè)微生物技術。