重組畢赤酵母表達(dá)蛋清溶菌酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

孫瑋遙，宋增健，王向東，林劍*

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264005；2.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南250100）

重組畢赤酵母表達(dá)蛋清溶菌酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

孫瑋遙1，宋增健1，王向東2，林劍1*

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264005；2.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南250100）

該研究以甲醇誘導(dǎo)型重組畢赤酵母（Pichia pastoris）NCY-2為研究菌株，在搖瓶水平上首先考察了誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇含量、誘導(dǎo)pH及誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋清溶菌酶表達(dá)的影響，然后通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化出了該菌株的最佳發(fā)酵條件，并進(jìn)一步研究了搖瓶發(fā)酵過(guò)程中的菌體生長(zhǎng)和酶活力隨時(shí)間的變化規(guī)律。研究結(jié)果表明，蛋清溶菌酶的最適誘導(dǎo)時(shí)間為96 h，甲醇含量為2%，誘導(dǎo)pH值為3.5，誘導(dǎo)溫度為20℃；在此條件下發(fā)酵液的蛋清溶菌酶酶活力達(dá)到775 U/mL，是優(yōu)化前的2.2倍。

蛋清溶菌酶；畢赤酵母；發(fā)酵條件；優(yōu)化

抗生素濫用給人體健康和環(huán)境造成了極大的危害，尤其是用作飼料添加劑造成的畜禽亞健康問(wèn)題，加劇了抗性質(zhì)粒的傳播速度，對(duì)人類自身造成了極大的安全隱患。因此，開(kāi)發(fā)綠色、安全、高效的抗生素替代品引起了社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。溶菌酶是一種天然存在的酶，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，且對(duì)人畜本身無(wú)任何毒副作用，現(xiàn)已逐漸應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)領(lǐng)域，成為傳統(tǒng)抗生素的替代品[1]。

溶菌酶是一種能夠水解微生物細(xì)胞壁的堿性酶，主要抑菌機(jī)理是切斷細(xì)胞壁肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1,4糖苷鍵，使菌體裂解死亡[2]。目前，從雞蛋清中提取溶菌酶[3]已達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平，市售溶菌酶大多由該方法制得，但價(jià)格昂貴，因而限制了低附加值畜禽產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有基因操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、外源蛋白表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于溶菌酶的異源表達(dá)[4]。

目前，國(guó)內(nèi)已公開(kāi)報(bào)道的用重組畢赤酵母表達(dá)蛋清溶菌酶（egg white lysozyme，EWL）在反應(yīng)器水平上的最高產(chǎn)量?jī)H為10 mg/L[5]，與已報(bào)道的400 mg/L差距非常大[6]，且尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此，如何提高溶菌酶在該系統(tǒng)中的表達(dá)量有著重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。現(xiàn)階段關(guān)于蛋清溶菌酶的研究報(bào)道多集中于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方面[7-8]，對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化缺乏系統(tǒng)的研究。盡管利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)其他目的產(chǎn)物（如植酸酶、水蛭素等），已得到了相對(duì)成熟的發(fā)酵工藝，但是相同表達(dá)載體因插入的外源基因不同，其目的產(chǎn)物的表達(dá)條件必定會(huì)有一定的差異，因此深入研究蛋清溶菌酶在重組畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的發(fā)酵工藝條件對(duì)于提高其表達(dá)量具有重要意義。

本研究采用山東大學(xué)構(gòu)建的一株甲醇誘導(dǎo)型重組畢赤酵母發(fā)酵表達(dá)蛋清溶菌酶，在搖瓶水平上首先考察了誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇含量、誘導(dǎo)pH及誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋清溶菌酶表達(dá)的影響，然后通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化出了該菌株的最佳發(fā)酵條件，并進(jìn)一步研究了搖瓶發(fā)酵過(guò)程中的菌體濃度和酶活力隨時(shí)間的變化規(guī)律，為實(shí)現(xiàn)生物反應(yīng)器水平的高密度發(fā)酵提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

甲醇誘導(dǎo)型重組畢赤酵母菌株（Pichiapastoris）NCY-2：山東大學(xué)應(yīng)用生命科學(xué)研究中心構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：1%酵母浸粉，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖。

BMGY培養(yǎng)基：1%酵母浸粉，2%胰蛋白胨，1.34%無(wú)氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB），4×10-5%生物素，0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.0）100 mL，1%甘油。

BMMY培養(yǎng)基：1%酵母浸粉，2%胰蛋白胨，1.34% YNB，4×10-5%生物素，0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.0）100 mL，0.5%甲醇。

1.1.3 化學(xué)試劑

酵母浸粉：安琪酵母股份有限公司；胰蛋白胨：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)氨基酵母氮源、生物素：北京索萊寶科技有限公司；溶菌酶檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AR1530電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；Anke TKL-5-A離心機(jī)：上海標(biāo)儀儀器有限公司；ZWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；G180TW全制動(dòng)高壓滅菌鍋：致微儀器有限公司；DK-98-11多功能萬(wàn)用爐：天津泰斯儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

配制YPD培養(yǎng)基于300 mL錐形瓶中，裝液量為10%，滅菌冷卻至30℃左右接種，于30℃、200 r/min的恒溫振蕩器中連續(xù)培養(yǎng)20 h。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

取1 mLYPD種子液接種于裝有100 mL滅菌BMGY培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，30℃、200r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24h。之后，室溫?zé)o菌條件下3 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集菌體，用100 mL滅菌的BMMY培養(yǎng)基重懸，開(kāi)始甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。此階段對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇含量、誘導(dǎo)pH以及誘導(dǎo)溫度四個(gè)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高蛋清溶菌酶的表達(dá)量（甲醇采用間歇流加的方式，每24 h添加一次無(wú)水甲醇，添加量占發(fā)酵液初始體積的0.5%（V/V）；培養(yǎng)基pH由H3PO4和KOH調(diào)節(jié)）。

誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化：保持BMMY培養(yǎng)基的初始pH值為6，甲醇含量為0.5%，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h時(shí)取樣檢測(cè)蛋清溶菌酶活性。

甲醇含量的優(yōu)化：保持BMMY培養(yǎng)基的初始pH值為6，依次改變甲醇含量為0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)96 h，分別取樣檢測(cè)蛋清溶菌酶活性。

誘導(dǎo)pH值的優(yōu)化：依次調(diào)節(jié)BMMY培養(yǎng)基的初始pH值為3、4、5、6、7，甲醇含量為2.5%，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)96h，分別取樣檢測(cè)蛋清溶菌酶活性。

誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化：保持BMMY培養(yǎng)基的初始pH值為6，甲醇含量為2.5%，依次置于20℃、24℃、26℃、30℃的恒溫振蕩器中培養(yǎng)，每隔24 h分別取樣檢測(cè)HEWL的活性。

1.3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以蛋清溶菌酶活性為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

表1 蛋清溶菌酶活性表達(dá)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for expression of egg white lysozyme activity fermentation conditions optimization

1.3.4 測(cè)定方法

溶菌酶活性的測(cè)定：收集發(fā)酵液上清，利用溶菌酶測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）測(cè)定上清中溶菌酶含量。試劑盒操作中以溶壁微球菌為底物，37℃水浴中反應(yīng)15 min，于波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定透光度的變化值，以空白為對(duì)照，以溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品（200 U/mL）為參考，通過(guò)透光度的高低計(jì)算樣品的酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋清溶菌酶表達(dá)的影響

圖1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋清溶菌酶活性的影響Fig.1 Affect of induction time on egg white lysozyme activity

對(duì)于甲醇誘導(dǎo)型重組畢赤酵母而言，發(fā)酵誘導(dǎo)時(shí)間直接影響菌體的生長(zhǎng)代謝活力以及外源蛋白表達(dá)量的高低。誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)短，目的蛋白表達(dá)量低；誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌體的代謝活力減弱，且發(fā)酵液中蛋白酶的積累易造成目的蛋白的大量水解，發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)也會(huì)增加生產(chǎn)成本。因此，優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)于提高生產(chǎn)效率、降低成本具有重要意義。蛋清溶菌酶的表達(dá)活性隨誘導(dǎo)時(shí)間的變化（圖1）可知，從生長(zhǎng)期進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)期后，菌體開(kāi)始利用誘導(dǎo)劑甲醇表達(dá)外源蛋白。隨著甲醇含量的增加，蛋清溶菌酶的表達(dá)活性逐漸增高，連續(xù)誘導(dǎo)96 h之后，由于菌體的衰亡以及蛋白酶等物質(zhì)的積累，蛋清溶菌酶活性開(kāi)始持續(xù)下降，此時(shí)應(yīng)及時(shí)停止發(fā)酵，避免造成生產(chǎn)成本的浪費(fèi)。因此，選擇甲醇誘導(dǎo)時(shí)間為96 h。

2.2 甲醇含量對(duì)蛋清溶菌酶表達(dá)的影響

菌體生長(zhǎng)到穩(wěn)定期達(dá)到最大數(shù)量后，需要流加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。一方面，甲醇在啟動(dòng)子AOX基因編碼的醇氧化酶的催化下分解，調(diào)控表達(dá)目的蛋白[11]；另一方面，甲醇用作碳源，維持菌體的正常生長(zhǎng)代謝。因此，甲醇含量是發(fā)酵表達(dá)外源蛋白的關(guān)鍵條件。不同甲醇含量對(duì)蛋清溶菌酶表達(dá)活性的影響見(jiàn)圖2。

圖2 甲醇含量對(duì)蛋清溶菌酶活性的影響Fig.2 Effect of methanol concentration on egg white lysozyme activity

一般認(rèn)為，畢赤酵母表達(dá)體系的發(fā)酵液中，當(dāng)甲醇含量＞3%時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[12]，所以本試驗(yàn)研究了＜3%的甲醇含量梯度對(duì)蛋清溶菌酶表達(dá)活性的影響。由圖2可以看出，當(dāng)甲醇含量從0.25%增加至2.5%時(shí)，蛋清溶菌酶活性呈逐漸增大趨勢(shì)，而＞2.5%后，過(guò)量的甲醇對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用，導(dǎo)致蛋清溶菌酶的表達(dá)量大幅度下降。因此，選擇每24 h流加的甲醇含量為2.5%。

2.3 誘導(dǎo)pH值對(duì)蛋清溶菌酶表達(dá)的影響

pH作為發(fā)酵過(guò)程中重要的化學(xué)參數(shù)，對(duì)發(fā)酵液的物理性質(zhì)、細(xì)胞膜的電荷狀態(tài)及參與細(xì)胞反應(yīng)的酶活性等有重要影響，因而影響目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。據(jù)研究報(bào)道，pH值在3.0～7.0的范圍內(nèi)畢赤酵母均可以正常生長(zhǎng)，pH＜2.2時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)受到抑制[13]。研究3.0～7.0范圍內(nèi)的pH值變化對(duì)蛋清溶菌酶表達(dá)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 誘導(dǎo)pH值對(duì)蛋清溶菌酶活性的影響Fig.3 Effect of induction pH on egg white lysozyme activity

由圖3可知，當(dāng)誘導(dǎo)pH值＜4時(shí)，蛋清溶菌酶的表達(dá)量極低，由此可以看出發(fā)酵液酸性較強(qiáng)時(shí)會(huì)明顯抑制畢赤酵母的生長(zhǎng)及代謝；當(dāng)誘導(dǎo)初始pH值為4時(shí)，蛋清溶菌酶的表達(dá)量最高；當(dāng)pH值＞4后，隨著發(fā)酵液pH值的增大，蛋白表達(dá)量逐漸降低，主要原因可能是發(fā)酵液中中性蛋白酶的逐漸積累造成了蛋白的水解[14]；因此，調(diào)節(jié)誘導(dǎo)期發(fā)酵液pH值為4時(shí)最有利于蛋清溶菌酶的表達(dá)和積累。

2.4 誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋清溶菌酶表達(dá)的影響

溫度對(duì)菌體的生長(zhǎng)以及外源蛋白的表達(dá)都有重要影響。因此，選擇合適的發(fā)酵溫度極其重要。畢赤酵母的最適生長(zhǎng)溫度是30℃，而誘導(dǎo)表達(dá)的溫度則因外源蛋白的不同存在差異，但一般都不超過(guò)32℃，因?yàn)檩^高溫度條件下外源蛋白表達(dá)量顯著下降，細(xì)胞衰亡速率增加。同時(shí)，不少研究者指出，低溫更有利于誘導(dǎo)外源蛋白的合成[15-16]。因此，本試驗(yàn)選擇了20～30℃的溫度范圍。不同溫度條件下蛋清溶菌酶的表達(dá)量隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖4。

圖4 誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋清溶菌酶活性的影響Fig.4 Effect of induction temperature on egg white lysozyme ectivity

由圖4可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溫度條件下的蛋清溶菌酶表達(dá)量逐漸增加，均在第96 h時(shí)達(dá)到最大值（與2.1.1結(jié)論一致）。不同溫度條件下蛋清溶菌酶的表達(dá)量差異較大，從第72 h開(kāi)始，30℃條件下蛋清溶菌酶的活性最低，隨著溫度的降低，蛋清溶菌酶的表達(dá)活性增加，且20℃條件下蛋清溶菌酶活性的增加幅度最大，最高表達(dá)量是30℃條件下的1.86倍。主要原因可能是低溫增強(qiáng)了重組畢赤酵母細(xì)胞的物質(zhì)及能量代謝，提高了細(xì)胞存活率，同時(shí)降低了胞外蛋白酶的作用效果，減少了蛋清溶菌酶的降解，并有利于蛋清溶菌酶構(gòu)象的正確折疊，從而提高了蛋清溶菌酶的表達(dá)量[17]。因此，選擇誘導(dǎo)溫度為20℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

蛋清溶菌酶活性表達(dá)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 蛋清溶菌酶活性表達(dá)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for expression of egg white lysozyme activity fermentation conditions optimization

由表2可知，影響蛋清溶菌酶表達(dá)量的4個(gè)因素主次關(guān)系為D（甲醇含量）＞A（誘導(dǎo)時(shí)間）＞B（誘導(dǎo)溫度）＞C（誘導(dǎo)pH）。最優(yōu)方案為A2B2C1D1，即誘導(dǎo)時(shí)間96 h，誘導(dǎo)溫度20℃，誘導(dǎo)pH 3.5，甲醇含量2%。對(duì)正交試驗(yàn)所確定的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，在最優(yōu)方案條件下蛋清溶菌酶活性的平均值為775 U/mL，高于試驗(yàn)5所得的結(jié)果。是優(yōu)化前（349 U/mL）的2.2倍。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，甲醇含量對(duì)蛋清溶菌酶活性的影響最大，其次是誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)pH。且4個(gè)因素對(duì)蛋清溶菌酶活性的影響均達(dá)到高度顯著（P＜0.01）。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到了影響蛋清溶菌酶表達(dá)量的4個(gè)因素的最優(yōu)條件：甲醇含量2%，誘導(dǎo)時(shí)間96 h，誘導(dǎo)溫度20℃，誘導(dǎo)pH 3.5。在此優(yōu)化條件下蛋清溶菌酶的搖瓶表達(dá)量達(dá)到了775 U/mL。

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Optimization of fermentation conditions for expression of egg white lysozyme by recombination

Pichia pastoris SUN Weiyao1,SONG Zengjian1,WANG Xiangdong2,LIN Jian1*
(1.College of Life Science,Yantai University,Yantai 264005,China;2.School of Medicine,Shandong University,Jinan 250100,China)

Using methanol inducible recombinantPichia pastorisNCY-2 which produces egg-white lysozyme(EWL)as experimental strain,the effect of induction time,methanol concentration,induction pH and temperature on the expression of EWL were investigated by single factor experiments in shake flasks and the optimum fermentation conditions were obtained through orthogonal experiment design.The variation of cell growth and EWL activity with time in shake flask fermentation was further studied.The results showed that the optimal conditions were induction time 96 h,methanol concentration 2%,induction pH 3.5 and temperature 20℃.The EWL activity reached 775 U/ml under the optimized conditions,which was 2.2 times compared with that before optimization.

egg white lysozyme;Pichia pastoris;fermentation conditions;optimization

Q815

0254-5071（2017）02-0054-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.012

2016-11-02

國(guó)家自然科學(xué)基金（81370881）；煙臺(tái)大學(xué)研究生科技創(chuàng)新基金重點(diǎn)項(xiàng)目（YDZD1610）

孫瑋遙（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。

*通訊作者：林劍（1963-），男，副教授，本科，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。