RP—HPLC法測定黔產大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量

韓忠耀++李燕++李方方++陸廷祥++楊樹祥++魏學軍

【摘要】目的：采用高效液相色譜法測定黔產大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量，為其質量控制提供依據。方法：采用Agela Promosil C18色譜柱（46mm×250mm，5μm），以乙腈-05%磷酸水為流動相進行梯度洗脫，流速為10mL/min，柱溫為35℃，檢測波長為220nm，分析時間為65 min，對16批黔產大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷進行了含量測定。結果：紫丁香苷在02881～28805μg（r=09995）范圍內與峰面積呈良好的線性關系；平均加樣回收率（n=6）為10053%，RSD為168%。結論：該方法簡便、快速、準確，可為大接骨丹根皮藥材的質量控制提供參考。

【關鍵詞】大接骨丹；高效液相色譜法；紫丁香苷；質量控制

【中圖分類號】R914【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）04-0030-03

Determination of Syringin Contents in Root Bark of Toricellia Angulata OlivvarIntermedia

（Harms） Hu in Guizhou by RP-HPLCHAN Zhongyao1LI Yan1LI Fangfang1LU Tingxiang1YANG Shuxiang1WEI Xuejun1*

1Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun 558000，China；

2ShangCai County Peoples Hospital， ShangCai 463800，ChinaAbstract：Objective To establish an HPLC method for the content determination of syringin in the root bark of Toricellia Angulata Olivvarintermedia（Harms） Hu for its quality controlMethod Agela Promosil C18（46mm×250mm，5μm）column was used and eluted with the mobile phase of acetonitrile-05% phosphoric acid solution in a gradient mode，the flow rate was 10mL/min，column temperature was 35 ℃The detection wavelength was at 220 nm，the analytical time was 65 min Syringin of 16 batches in the root bark of Toricellia Angulata Olivvarintermedia （Harms） Huwere detectedResult The linear ranges for syringin was 02881～28805μg（r=09995）Their average recoveries（n=6） were 10053% and the RSD was 168%，respectivelyConclusion The method is simple，rapid，accurate and can be used for quality control of the root bark of Toricellia Angulata Olivvarintermedia（Harms） Hu

Keywords： Toricellia Angulata Olivvarintermedia（Harms） Hu；HPLC； Syringin；Quality Control

大接骨丹為山茱萸科鞘柄木屬植物齒裂鞘柄木Toricellia Angulata Olivvarintermedia（Harms） Hu的根、葉、花，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》，是貴州少數民族聚集地、苗醫院及市（州）級中醫院應用廣泛的民族藥之一，別名水冬瓜、水五加、接骨丹等，具有活血祛瘀、舒筋接骨的功效，主要用于哮喘、瘀血勞傷、骨折、跌撲損傷等[1]。《中華本草》等記載該藥味苦、辛、微麻，性平，用于風濕關節痛、產后腰痛、慢性腸炎、腹瀉，外用治骨折、跌打損傷等[2-3]。由于該藥臨床療效好，是治療各類骨折、跌打損傷、肌肉勞傷等癥的理想用藥，該藥被《黔南本草》[4]、《貴州民間方藥集》[5]等諸多地方本草收載。目前，國內外對大接骨丹藥材的研究主要集中在化學成分相關研究，如大接骨丹藥材主含苯丙素苷、環烯醚萜苷、黃酮苷、二萜等化學成分，已確定的單體化合物如紫丁香苷[6]、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、黃芪苷、β-谷甾醇、硬脂酸、軟脂酸、10-Griselinosidic acid等[6-11]，同時，現代生物活性實驗研究表明大接骨丹樹皮具有較好的抗炎、鎮痛[12]、免疫抑制[10-11]等作用，而關于大接骨丹根皮含量測定相關研究尚未見報道。研究表明，紫丁香苷具有抗炎[13-14]、保肝作用[15-16]等生物活性，這可能與該藥在臨床與民間的廣泛應用有密切關系，紫丁香苷為該藥的活性成分之一。課題組根據預實驗的結果并結合后期實驗研究的基礎上，首次采用反相高效液相色譜梯度洗脫法建立了黔產大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量測定方法，并對收集到的16批黔產大接骨丹根皮藥材進行了含量測定，為大接骨丹根皮藥材的質量控制及合理開發利用資源提供參考與依據。

1儀器與材料

11儀器Agilent 1260型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器，在線真空脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱及Chemstaion化學工作站，美國安捷倫科技公司）；BP211型電子分析天平（德國賽多利斯）。

12材料紫丁香苷對照品（批號：160120，成都克洛瑪生物科技有限公司），乙腈（色譜純，批號：20160710，天津科密歐化學試劑有限公司），磷酸（分析純，批號：20140201，重慶川東化工（集團）有限公司），水為娃哈哈礦泉水（批號：20160504，杭州娃哈哈集團有限公司），乙醇（分析純，批號：20160401，重慶川東化工（集團）有限公司），其他試劑均為分析純。

16批大接骨丹根皮藥材均為自采，所有藥材均經黔南民族醫學高等專科學校藥學系中藥教研室王傳明副教授鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia Angulata Olivvarintermedia（Harms） Hu的根皮。見表1。

2方法與結果

21溶液的制備

211對照品溶液精密稱取紫丁香苷對照品適量，置于25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得到紫丁香苷照品儲備液濃度為05761mg/mL。

表1大接骨丹根皮藥材來源NO.產地NO.產地S1貴州都勻S9貴州長順S2貴州惠水S10貴州都勻S3貴州惠水S11貴州都勻S4貴州惠水S12貴州綏陽S5貴州長順S13貴州綏陽S6貴州長順S14貴州綏陽S7貴州都勻S15貴州黔西S8貴州惠水S16貴州黔西

212供試品溶液稱取大接骨丹根皮藥材粉末（過四號篩）約05g，精密稱定，置50mL圓底燒瓶中，精密加入甲醇10mL，稱定重量，回流提取1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液用045 μm 微孔濾膜濾過，即得。

22色譜條件采用Agela Promosil C18色譜柱（46mm×250mm，5μm），檢測波長為220nm，進樣量為10 μL，柱溫為35 ℃，流速為10 mL/min，流動相為乙腈（A）-05%磷酸水（B）梯度洗脫（0～20min，10%～25% A；20～50min，25%～65% A；50～501min，65%～10% A；501～65min，10% A），記錄65 min的色譜圖。對照品和大接骨丹根皮藥材樣品的色譜圖見圖1。

23方法學考察

231線性關系考察分別精密吸取紫丁香苷對照儲備液05、1、2、3、4、5 mL于10mL量瓶中，分別用甲醇稀釋到刻度，搖勻，即得。分別注入高效液相色譜儀并測定各成分的色譜峰面積，得到進樣量C（μg）與峰面積A的線性方程。結果表明，紫丁香苷進樣量在02881～28805μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系，線性方程分別為A=69689C+ 21178 （r=09995）。

232精密度試驗取對照品溶液，連續進樣6次，測定紫丁香苷峰面積。結果表明，計算紫丁香苷的RSD值為108%，表明儀器精密度良好。

233重復性試驗取大接骨丹根皮藥材樣品6份，按照“212”項下的方法進行操作，制備供試品溶液，按“22”項下色譜條件分別進樣分析，測得紫丁香苷峰面積的RSD值為224%，表明該分析方法重復性良好。

234穩定性試驗取大接骨丹根皮（S3）供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24、36h進行分析，考察紫丁香苷峰面積，結果表明，紫丁香苷峰面積的RSD值為236%，表明供試品溶液在36 h內基本穩定。

235加樣回收率試驗精密稱取已知含量的大接骨丹根皮（S3）藥材粉末約025g，共6份，每組分別精密加入05701g/L紫丁香苷對照品溶液1mL，混合均勻，按照“212”項下的方法進行操作，制備供試品溶液，按“22”項下色譜條件分別進樣分析。結果表明，紫丁香苷平均加樣回收率（n=6）為10053%，RSD為168%，結果見表2。

表2加樣回收率試驗結果（n=6）成分取樣量/g原有量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%紫丁香苷025310579605701115110023025180576605701114399350251905769057011138984202541058190570111711033302524057800570111551012102507057410570111481006710053168

2 4樣品含量測定分別按照“212”項下的方法進行操作，制備供試品溶液，按“22”項下色譜條件分別進樣分析，對16批自采大接骨丹根皮（即水冬瓜根皮）藥材進行含量測定，計算紫丁香苷的含量，結果見表3。

表316批大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量

NO產地紫丁香苷/mg·g-1S1貴州都勻059S2貴州惠水185 S3貴州惠水229 S4貴州惠水171 S5貴州長順256S6貴州長順068S7貴州都勻313 S8貴州惠水133 S9貴州長順101 S10貴州都勻176S11貴州都勻187 S12貴州綏陽265 S13貴州綏陽402 S14貴州黔西555 S15貴州黔西115S16貴州綏陽118 3討論

31樣品提取條件的優化試驗考察比較了甲醇、70%乙醇、90%乙醇等不同溶劑和超聲、回流、冷浸等方法，其中，以甲醇回流提取1h 提取效果較好。

32色譜條件的優化預試驗應用二極管陣列檢測器對大接骨丹根皮藥材波長進行檢測，參照3D立體圖構向分析，發現在220nm 處，紫丁香苷色譜吸收相對較大且分離度高，在線梯度洗脫時，基線平穩，故確定檢測波長為220nm。考察了甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-水、乙腈-磷酸水等流動相系統，結果表明本實驗采用乙腈-磷酸水具有較高的分離度。考察了不同色譜柱、不同柱溫及不同流速下的分離效果，最終確定了本實驗的色譜分析條件。

33含量測定指標性成分的選擇含量測定指標性成分的選擇時，通常選擇峰面積較大且保留時間居中的色譜峰作為指標性成分，但是，由于2-8號峰為未知化學成分，根據文獻[2-6]，課題組利用液質聯用技術及對照品比較法嘗試對大接骨丹根皮藥材中的多種化學成分進行指征，但由于該藥物質基礎研究相對薄弱，課題組通過液質聯用技術及對照品比較法，僅指征了圖譜中1號峰為“紫丁香苷”，并最終確定1號峰紫丁香苷作為本研究含量測定的指標性成分。

含量測定結果表明，自采的16批黔產大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量差異較大，說明各批次藥材質量存在明顯差異，各產地藥材成分含量差異較大的原因可能是由于大接骨丹藥材的生長環境、不同采收期、不同生長期等影響因素造成。同時，應加強針對大接骨丹根皮（即水冬瓜根皮）物質基礎的深入研究，同時，基于物質基礎，開展指紋圖譜的深入研究[17]，對大接骨丹根皮（即水冬瓜根皮）不同部位、不同采收期確定研究以及質量標準的提升。

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（收稿日期：2016-12-16編輯：梁志慶）文獻綜述