甾體類化合物免疫抑制毒性體外篩選終點指標的選擇研究

宋秀春?，呂金艷

（呼倫貝爾市人民醫院體檢科，內蒙古 呼倫貝爾 021008）

地塞米松是一種具有強免疫抑制作用的糖皮質激素類化合物，廣泛用于各種炎癥性疾病、自身免疫性疾病、過敏性疾病及器官移植排斥的治療。在藥物開發中，地塞米松被作為免疫調節藥物研究的陽性藥[1-3]。

經過長期研究，地塞米松對于各種免疫細胞的調節作用已經積累大量數據，其中地塞米松對于CD4+T細胞活化、增殖和分化的抑制作用也是很明確的。然而，地塞米松對于CD4+T細胞活化標志物的調節作用研究不夠明確，特別是對于CD69的表達調節作用還存在矛盾的結果。因此，進一步研究地塞米松對于CD4+T細胞活化標志物的調節作用，對于利用流式細胞術研究免疫調節藥物對于CD4+T細胞活化具有重要意義。本研究將利用流式細胞術分析地塞米松對于CD4+T細胞活化標志物CD69和CD25的調節作用

1 儀器與材料

1.1 儀器

流式細胞儀：購自BDBiosciences公司（FACSCantoTMⅡ）。

1.2 動物

8周齡雄性Balb/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物有限公司。

1.3 試劑

倉鼠抗小鼠CD3e和CD28抗體（貨號：BR31101和BR31103），購自北京佰瑞達生物科技有限公司；大鼠抗小鼠單克隆抗體FITC-CD69、PECD25和PE-CY7-CD4 （貨號：553237、558642、552775），購自BD Biosciences公司；地塞米松（貨號：D1756），購自Sigma-Aldrich公司。

2 方 法

2.1 小鼠脾臟白細胞制備

無菌取小鼠脾臟放入70 μM無菌濾網中，用5 mL注射器內芯研磨，并用20 mL的PBS沖洗，獲得小鼠脾臟細胞懸液；然后200 g離心5分鐘，棄上清，加入10 mL紅細胞裂解液裂解紅細胞，然后加入20 mL RPMI1640培養基終止裂解，200 g離心5分鐘，棄上清；再利用10 mL的含10%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸細胞，然后200 g離心5分鐘，棄上清；最后再利用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸細胞（含氨芐青霉素和鏈霉素），并通過細胞計數將細胞濃度稀釋到1×107個/mL。

2.2 流式細胞術測定CD4+ T細胞活化標志物

利用PBS稀釋大鼠抗小鼠CD3e抗體到2 μg/mL，加入24孔板，每孔250 μL，4℃包被過夜；將小鼠脾臟白細胞接種到未包被抗體24孔板中，1×106個/孔，作為對照組，將細胞接種到包被抗體的24孔板中，作為模型組和地塞米松組，加入大鼠抗小鼠CD28抗體至終濃度為2 μg/mL；在地塞米松組加入地塞米松至終濃度為10 μM；37℃，5% CO2條件下繼續培養24小時；然后收集細胞按說明書標記大鼠抗小鼠單克隆抗體FITC-CD69、PE-CD25和PE-CY7-CD4，利用流式細胞儀檢測CD4+T細胞表面CD69和CD25的表達。

2.3 統計分析

數據資料均用平均值±標準差（M±SD）表示，所有實驗均重復至少三次；利用GraphPad 5.0進行統計分析，Student’s t檢驗分析組間差異；P＜0.05被設定為具有統計學差異。利用Flowjo7.6.1處理流式細胞圖。

3 結 果

3.1 地塞米松對CD4+ T細胞活化標志物CD69的調節作用

經流式細胞測定，CD4+T細胞受大鼠抗小鼠CD3e/CD28抗體刺激后，CD69的表達均顯著上升，地塞米松對CD69表達上調無顯著抑制作用（P＞0.05），如圖1所示。

圖1 地塞米松（DEX）對CD4+ T細胞活化標志物

CD69的調節作用測定。小鼠脾臟白細胞接種到包被大鼠抗小鼠CD3e抗體的24孔板中，加入或不加入地塞米松處理，再加入大鼠抗小鼠CD28抗體，培養24 h，利用流式細胞術測定CD4+T細胞表面CD69（A，B）表達。#P＜0.05 vs Control；*P＜0.05 vs Model。

3.2 地塞米松對CD4+ T細胞活化標志物CD25的調節作用

經流式細胞測定，CD4+T細胞受大鼠抗小鼠CD3e/CD28抗體刺激后，CD25的表達均顯著上升，地塞米松對CD25表達上調具有顯著抑制作用（P＜0.05），如圖2所示。

圖2：地塞米松（DEX）對CD4+ T細胞活化標志物

CD25的調節作用測定。小鼠脾臟白細胞接種到包被大鼠抗小鼠CD3e抗體的24孔板中，加入或不加入地塞米松處理，再加入大鼠抗小鼠CD28抗體，培養24 h，利用流式細胞術測定CD4+T細胞表面CD25（A，B）表達。#P＜0.05 vs Control；*P＜0.05 vs Model。

4 討 論

CD4+T細胞是哺乳動物及人類發揮適應性免疫功能的重要細胞。CD4+T細胞又稱為輔助型T細胞，在接受抗原提呈細胞MHCⅡ類分子提呈的抗原刺激及共刺激信號后迅速活化，細胞表面CD69，CD25等活化標志物迅速上調，利用流式細胞術可以方便地監測CD4+T細胞活化[4-7]。

本研究主要研究具有廣譜免疫抑制作用陽性藥地塞米松對CD4+T細胞活化標志物CD69和CD25的調節作用，從而為新型免疫抑制劑的免疫調節作用研究提供參考。研究結果表明地塞米松對CD4+T細胞表面CD69上調無抑制作用，而對CD25上調具有顯著抑制作用；因此，如果利用流式細胞篩選免疫抑制劑，特別是甾體類化合物，適合選擇CD25表達量為CD4+T細胞抑制作用的終點指標。

[1]Sitaula S,Burris T P.Cholesterol and other steroids [J].Encyclopedia of Cell Biology,2016,1: 173-179.

[2]Ferreira J F,Mohamed A A,Emery P.Glucocorticoids and Rheumatoid Arthritis [J].Rheumatic Diseases Clinics of North America,2016,42 (1): 33-46.

[3]Zennaro M C,Boulkroun S,Fernandes-Rosa F.Inherited forms of mineralocorticoid hypertension.Best Practice & Research Clinical Endocrinology &Metabolism,2015,29(4): 633-645.

[4]Tiwari N,Gupta V K,Pandey P,et al.Adjuvant effect of Asparagus racemosus wild derived saponins in antibody production,allergic response and pro-in fl ammatory cytokine modulation [J].Biomedicine & Pharmacotherapy,2017,86:555-561.

[5]Gasteiger G,Rudensky A Y.Interactions between innate and adaptive lymphocytes [J].Nature Reviews Immunology,2014,14: 631-639.

[6]Netea M G,Joosten L A B,Meer J W M,et al.Immune defense against Candida fungal infections [J].Nature Reviews Immunology,2015,15: 630-642.

[7]Dendrou C A,Fugger L,Friese M A.Immunopathology of multiple sclerosis [J].Nature Reviews Immunology,2015,15: 545-558.