睪丸彌漫大B細胞淋巴瘤中MyD88及CD79B基因突變及意義

馬世榮，劉 楊，劉 芳，王映梅，王 哲，郭雙平

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是一種高度異質性的淋巴瘤，包括不同的基因表達譜,基因異常以及不同的臨床表現和疾病預后[1]。睪丸原發性DLBCL以其獨特的臨床表現和分子特征不同于普通型DLBCL，睪丸原發性DLBCL是少見的高度侵襲性非霍奇金淋巴瘤，好發于60歲以上的老年男性[2-3]。根據分子分型分為生發中心B(germinal center B, GCB)細胞型及非生發中心B(non germinal center B, non-GCB)細胞型[4]。與GCB型DLBCL比較，non-GCB型具有預后不良及化療反應差等特點，因此從腫瘤分子生物學及細胞遺傳學方面進一步探尋腫瘤發生、發展及耐藥的機制，為DLBCL的治療提供新的治療靶點已經成為目前研究的重點。近年來，有研究發現non-GCB型DLBCL中存在NF-κB途徑的持續過度激活，NF-κB途徑的激活與其上游通路的B細胞受體(CD79B)及髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)的突變密切相關[5-6]。目前有文獻報道在原發于睪丸的DLBCL中MyD88及CD79B基因突變率高于發生在其他部位的DLBCL[7-10]。因此，本組實驗針對MyD88、CD79B基因突變情況進行分析，初步探討中國人睪丸原發性DLBCL的基因突變情況。

1 材料與方法

1.1一般資料收集2002年1月～2014年3月在第四軍醫大學西京醫院診治的有完整臨床資料的15例睪丸原發性non-GCB型DLBCL患者，并進行隨訪。所有病例均經病理診斷確診，并根據Hans法分型。

1.2免疫組化及結果判讀手術標本均經10%中性福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋、連續切片，常規HE及免疫組化染色。所用抗體包括CD20、CD3、CD21、CD10、BCL-6、MUM1、Ki-67(Dako公司)，RelB、p52、p50和p65抗體(Abcam公司)，采用Ventana ultra View兩步法染色，用Roche Benchmark XT全自動免疫組化染色儀進行染色。CD3、CD20、CD21、CD10以胞膜呈彌漫性棕黃色顆粒為陽性，BCL-6、MUM1、Ki-67以胞核內見棕黃色顆粒為陽性，同時設立陽性對照和空白對照。其中CD10、BCL-6、MUM1的判讀，需>30%的腫瘤細胞表達抗體才可以評估為陽性[4]。

1.3PCR擴增和Sanger測序制備5～10 μm厚的組織塊，使用QIAamp DNA FFPE試劑盒(QiagenValencia, CA, USA)提取基因組DNA。CD79B基因突變檢測應用正向引物5′-TCTTGCAGAATGCACCTCAC-3′和反向引物5′-CAGGCCCTGGAGACATTAAG-3′對包含CD79B基因Y196位點編碼基因的DNA進行PCR擴增。MyD88基因突變檢測應用正向引物5′-TGCAGGGGTTGGTGTAGT-3′和反向引物5′-GTTGTTAACCCTGGGGTTG-3′對包含MyD88 L265位點編碼基因的DNA進行PCR擴增。PCR產物經15%瓊脂糖凝膠電泳，產物純化，由北京六合華大基因公司進行測序儀測序(美國ABI公司，型號3730XL)，使用BioEdit軟件分析測序圖。

2 結果

2.1臨床特點本組15例睪丸原發性DLBCL患者發病年齡為26～86歲(平均為60.1歲)，>60歲者10例(占66.7%)。4例(占26.7%)為左側睪丸受累，9例(占60%)為右側睪丸受累，2例(占13.3%)為雙側睪丸受累(表1)。15例患者首發癥狀均為患側睪丸無痛性腫大，腫瘤局限于睪丸，就診時未累及淋巴結或睪丸外其他器官。

2.2病理組織學及免疫表型眼觀：腫瘤界限清楚，直徑1.5～8 cm，平均直徑為5.6 cm，切面灰白、灰黃色，實性，質地中等。鏡檢：正常睪丸結構被破壞，腫瘤性淋巴細胞彌漫浸潤，腫瘤細胞體積較大、中等量胞質，細胞核呈圓形，細胞之間缺乏黏附性，呈彌漫浸潤性生長(圖1)。部分病例腫瘤細胞有單個大核仁位于細胞中心，呈免疫母細胞形態；部分病例腫瘤細胞核染色淡、呈空泡狀，有1個或多個靠近核膜的小核仁，呈中心母細胞形態；部分病例為混合型。免疫表型：15例睪丸原發性DLBCL腫瘤細胞均彌漫強陽性表達B細胞標志物CD20(圖2)，根據Hans法，即根據腫瘤細胞表達CD10、BCL-6及MUM1的情況進行分型，15例中CD10(圖3)及BCL-6(圖4)均陰性，MUM1陽性(圖5)，結果15例均為non-GCB型。腫瘤細胞Ki-67增殖指數為34%～95%，Ki-67平均增殖指數為64%(圖6)。

2.3CD79B及MyD88基因突變的檢測及臨床病理分析本組15例中有8例檢測到CD79B基因點突變或MyD88基因點突變或2個基因同時點突變，占53.3%，其中7例存在MyD88 L265P點突變(圖7)，占46.7%；4例檢測到CD79B Y196 F點突變(圖8)，占26.7%。3例同時存在CD79B Y196 F及MyD88 L265P突變，占20%。未發現CD79B或MyD88基因點突變與患者年齡、部位、形態學分型之間的關系。

2.4治療及預后15例患者均行患側睪丸切除術，且術后按照CHOP或R-CHOP方案進行化療。8例患者獲得隨訪資料，隨訪時間6～48個月，其中3例患者存活，5例患者死亡(表1)，未發現CD79B或MyD88基因突變與患者預后之間的聯系。

3 討論

睪丸原發性DLBCL非常少見，其預后差、具有特殊性，而non-GCB型DLBCL與GCB型相比其對化療的治療反應及預后更差[11-12]，目前關于睪丸原發性non-GCB型DLBCL的研究較少，特別是缺乏靶向治療的靶點。據文獻報道non-GCB型DLBCL具有較高的MyD88及CD79B的突變率[13-14]，因此針對這一現象，本組實驗首次檢測了發生在中國人的15例睪丸原發性non-GCB型DLBCL的CD79B及MyD88基因突變，并探討其臨床病理特征與突變之間的關系及意義。

表1 15例睪丸原發性彌漫大B細胞淋巴瘤的臨床病理學特點

non-GCB:非生發中心B細胞型

①②③④⑤⑥

圖1腫瘤細胞體積較大，核圓形，細胞之間彼此缺乏黏附性，細胞核內可見2～3個小核仁，類似于中心母細胞圖2腫瘤細胞胞膜彌漫表達CD20，Ventana ultra View兩步法圖3腫瘤細胞CD10陰性，Ventana ultra View兩步法圖4腫瘤細胞BCL-6陰性，Ventana ultra View兩步法圖5腫瘤細胞胞核強陽性表達MUM1，Ventana ultra View兩步法圖6腫瘤細胞Ki-67增殖活性為64%，Ventana ultra View兩步法

圖7A.睪丸原發性彌漫大B細胞淋巴瘤中MyD88基因L265位點未突變(對照組，CTG，Sanger測序)；B.睪丸原發性彌漫大B細胞淋巴瘤中MyD88基因L265P位點突變(檢測組，CTG>CCG，Sanger測序)

圖8A.睪丸原發性彌漫大B細胞淋巴瘤中CD79B基因Y196位點未突變(對照組，TAC，Sanger測序)；B.睪丸原發性彌漫大B細胞淋巴瘤中CD79B基因Y196 F位點突變(檢測組，TAC>TTC，Sanger測序)

3.1臨床特征睪丸原發性DLBCL是60歲以上老年人睪丸惡性腫瘤中最常見類型[15]，分子分型以non-GCB型為主[16]，本組15例睪丸原發性均為non-GCB型，患者年齡范圍為26～86歲，60歲以上患者占66.7%，與文獻報道相符合[17]。4例發生在左側睪丸，9例發生在右側睪丸，2例雙側睪丸受累，首發癥狀均為患側睪丸無痛性腫大，無睪丸外組織受累。

3.2MyD88基因突變檢測及意義MyD88基因是細胞質里一種可溶性銜接蛋白，屬于Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)/白介素-1受體(interleukin-1 receptor, IL-1R)家族和死亡結構域家族成員，介導多數TLR、IL-1R、白介素-18受體(interleukin-18 receptor, IL-18R)細胞信號傳導。近年來有研究發現多種B細胞淋巴瘤，包括9%胃黏膜組織相關淋巴瘤、5%的伯基特淋巴瘤以及約29%的non-GCB型和6%的GCB型DLBCL中存在MyD88基因L265P位點突變[14,18]。這種功能活化型突變可引發IL-1R相關激酶介導的NF-κB、MAPK及JAK-STAT3信號途徑的持續激活、放大，促進細胞惡性增殖，逃脫細胞周期，抑制阻滯細胞分化成熟，導致腫瘤形成[19]。NF-κB通路的異?；罨莕on-GCB型DLBCL的重要特征，而抑制其活化對腫瘤的治療是一種潛在的治療途徑。有研究報道，來那度胺可以阻斷NF-κB通路的活化，且來那度胺可以通過增加干擾素β(IFNβ)殺死有MyD88基因突變的淋巴瘤細胞[20]。Kraan等[9]檢測了177例DLBCL患者MyD88 L265P的突變情況，結果顯示，non-GCB型突變率為32.5%，且原發中樞神經系統及睪丸DLBCL的突變率較高，分別達75%及71%，而原發淋巴結內的DLBCL突變率僅17%。本組實驗檢測了15例睪丸原發性non-GCB型DLBCL中MyD88的突變，結果表明15例中有7例出現了MyD88的突變，占46.7%，與文獻報道的睪丸原發性non-GCB型DLBCL的MyD88突變率高相符合。因此，基于MyD88在睪丸原發性non-GCB型DLBCL中的高突變率，在部分由MyD88突變導致NF-κB通路活化進而促進DLBCL進展的患者中，來那度胺的使用可以作為一種治療策略。

3.3CD79B基因突變檢測及意義CD79B是B細胞受體(BCR)近端銜接子，有研究表明在non-GCB型DLBCL中，NF-κB信號轉導通路的激活與慢性活動性BCR信號激活后引發級聯反應有很大關系。研究發現絕大多數non-GCB型DLBCL細胞株依賴BCR的功能表達，使用基因敲除技術抑制BCR復合體成分表達或信號轉導組件時能有效殺死該細胞。其中BCR能引發細胞內相關信號生成的關鍵是免疫受體酪氨酸活化基序(TIAM)，它是在含CD79A和CD79B的BCR復合體中高度保守的多肽。約20%的non-GCB型DLBCL發生TIAM突變，其中CD79B的突變占21.1%，CD79A突變占2.9%，CD79B突變遠高于CD79A的突變[6]。因此，本組15例non-GCB型DLBCL進行了CD79B的Y196位點突變檢測，結果發現4例存在CD79B的Y196位點突變，占26.7%。這與文獻報道的21.1%的突變率相符合。

本組實驗發現具有CD79B的Y196位點突變的患者年齡與具有MyD88的L265位點突變的患者年齡差別不大，而同時具有CD79B的Y196位點和MyD88的L265位點突變的患者年齡明顯比具有單一突變的患者年齡大。具有單一或雙突變的睪丸原發性non-GCB型DLBCL患者年齡稍高于無突變的患者。由于獲得的隨訪資料有限，對于具有突變的睪丸原發性non-GCB型DLBCL患者的預后情況尚不明確。據文獻報道，non-GCB型DLBCL中CD79B和MyD88突變對患者的生存情況無顯著影響[21]。但檢測腫瘤組織中CD79B及MyD88的突變情況，能為臨床的靶向治療提供更多依據。

總之，睪丸原發性non-GCB型DLBCL是一種少見的特殊類型的淋巴瘤，具有化療反應差、預后不良等特點，診斷及治療均具有一定的困難，CD79B及MyD88在腫瘤中的高突變率可為腫瘤的分子靶向治療提供更有利的依據。

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