高粱幼穗再生體系建立的研究

陳曉木+李歐靜+施利利

摘要：高粱是重要的雜糧作物之一，其組織培養(yǎng)研究對高粱再生體系建立以及高粱轉(zhuǎn)基因育種具有重要意義。以6個基因型的高粱幼穗為外植體，研究光照、激素、基本培養(yǎng)基以及基因型對幼穗愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響。結(jié)果表明：對于高粱幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，光照有利于幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)；2，4-D和KT混合使用的效果比2，4-D單獨使用好；3種基本培養(yǎng)基對幼穗愈傷誘導(dǎo)影響差異不顯著；不同基因型對幼穗愈傷誘導(dǎo)影響差異顯著，且5種不同基因型材料的愈傷誘導(dǎo)能力大小為M81-E>07-27 > BJ-285=考利>羅馬。對于高粱幼穗愈傷組織的分化培養(yǎng)，3種培養(yǎng)基中只有MS培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基分化出再生苗；6種基因型中只有忻粱52分化出綠苗，分化率為11.49%。

關(guān)鍵詞：高粱；幼穗；組織培養(yǎng)；基因型

中圖分類號： S514.043 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0040-03

高粱是一種高光效的C4植物，具有生物產(chǎn)量高、耐旱、耐鹽、耐貧瘠、適應(yīng)性強、種植范圍廣等特點[1]，且高粱是重要的雜糧作物之一，其籽粒可以作為糧食，在非洲等干旱地區(qū)是主要的糧食作物之一，莖稈是良好的青貯飼料[2-3]。但是，高粱種質(zhì)資源比較匱乏[4]，傳統(tǒng)的育種應(yīng)用受到限制，致使其品種改良和新品種選育進程緩慢。轉(zhuǎn)基因育種的快速發(fā)展，為高粱育種帶來生機。然而，高粱被認為是組織培養(yǎng)比較困難的植物之一，雖然高粱的幼胚[5-14]、花藥[15-18]、幼穗[11，18-22]、幼葉[10，23]、莖尖[19，24-29]、成熟胚[10-11，30-31]、未成熟胚[12]、成熟種子[11，30，32-33]、原生質(zhì)體[34]的體外培養(yǎng)可以初步獲得再生植株，但是以組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)的高效再生體系建立比較困難。

目前，高粱幼穗被認為是建立再生體系比較容易的外植體之一。本試驗以6個基因型的高粱幼穗為外植體，研究光照、激素、基本培養(yǎng)基以及基因型對幼穗愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響，試圖建立幼穗高效再生體系，從而為高粱轉(zhuǎn)基因育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

6個高粱品種及品系：忻粱52、BJ-285、07-27、M81-E、羅馬及考利，均由天津農(nóng)學(xué)院作物遺傳重點實驗室提供，種植于天津農(nóng)學(xué)院東校區(qū)作物標本園，取旗葉期的幼穗先用75%乙醇擦拭苞葉，用保鮮膜包裝后置于4 ℃預(yù)處理12～24 h 備用。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 所有培養(yǎng)基用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值為5.8，分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基加3 g植物凝膠、8.0 g山梨醇和0.2 g天冬氨酸，其他培養(yǎng)基均加0.3 g酸水解酪蛋白、0.5 g脯氨酸、0.5 g谷氨酰胺以及6.8 g瓊脂，繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，在1.1 MPa大氣壓113 ℃下滅菌20 min （表1）。

1.2.2 幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)

將預(yù)處理后的幼穗用75%乙醇表面消毒，在超凈工作臺內(nèi)小心取出約7 cm長幼穗，在無菌濾紙上用解剖刀切成0.1～0.2 cm的莖段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。除忻粱52有處理置于（25±1） ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每天光照16 h，光照度為2 000 lx。其余皆置于（25±1） ℃ 的黑暗條件下培養(yǎng)，10～14 d統(tǒng)計出愈率。

1.2.3 愈傷分化、生根培養(yǎng)及移栽

繼代培養(yǎng)7～14 d，挑取黃色、質(zhì)地緊密的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，置于（25±1） ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每天光照16 h，光照度為2 000 lx。經(jīng)過28～35 d的分化培養(yǎng)，再生芽長到3 cm左右時，并統(tǒng)計分化率。待再生芽長到5 cm左右時，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上。待再生苗根系健壯時，移栽到含有蛭石和營養(yǎng)土的盆中于溫室中培養(yǎng)至植株成熟。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

愈傷誘導(dǎo)率=（愈傷組織塊數(shù)/外植體數(shù)）×100%；

愈傷分化率=（出再生芽愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織數(shù)）×100%。

數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后，用DPS統(tǒng)計軟件進行方差分析，用Duncans新復(fù)極差法進行顯著性水平分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱幼穗愈傷誘導(dǎo)

2.1.1 光照條件和激素對高粱幼穗愈傷組織誘導(dǎo)的影響

經(jīng)過10～14 d的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)，幼穗切段在切口處產(chǎn)生淡黃色或白色的愈傷組織。除忻粱52以外其他5個材料均不同程度產(chǎn)生褐色物質(zhì)（圖1）。

光照和激素對忻粱52幼穗愈傷組織誘導(dǎo)影響的方差分析結(jié)果（表2）表明，忻粱52在光照條件的愈傷誘導(dǎo)率與黑暗條件下的愈傷誘導(dǎo)率差異顯著，說明光照有利于幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)。而在相同條件下，忻粱52 在添加 0.5 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D情況下的愈傷誘導(dǎo)率顯著高于只添加 2.0 mg/L 2，4-D的愈傷誘導(dǎo)率，表明2，4-D和KT混合使用的效果比2，4-D單獨使用要好。

2.1.2 基本培養(yǎng)基對高粱幼穗愈傷組織誘導(dǎo)的影響

本試驗將MB、MS、NB等培養(yǎng)基對幼穗愈傷組織誘導(dǎo)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果（表3）表明，高粱幼穗在不同基本誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的愈傷誘導(dǎo)率差異不顯著（P<0.05）。說明MB、MS、NB 3種培養(yǎng)基對幼穗愈傷組織誘導(dǎo)影響不大。

2.1.3 基因型對高粱幼穗愈傷組織誘導(dǎo)的影響

本試驗將5種基因型材料幼穗愈傷組織誘導(dǎo)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果（表4）表明，不同基因型幼穗愈傷誘導(dǎo)率差異顯著（P<0.05），其中M81-E的平均愈傷誘導(dǎo)率最高，為75.78%，其次依次為07-27>BJ-285>考利>羅馬，BJ-285 和考利差異不顯著。

2.2 高粱幼穗愈傷分化

2.2.1 基本培養(yǎng)基、基因型對高粱幼穗愈傷組織分化的影響

將幼穗愈傷組織接種到含有3種基本培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，除忻粱52產(chǎn)生綠苗之外，其他材料的愈傷則大量形成根（圖2）。對3種基本培養(yǎng)基的愈傷分化率進行統(tǒng)計，結(jié)果（表5）表明，忻粱52在NB分化培養(yǎng)基上的分化率明顯高于MS，而其他材料無論是在MS分化培養(yǎng)基還是MB分化培養(yǎng)基上均不出現(xiàn)綠點，沒有再生苗的出現(xiàn)。說明基本培養(yǎng)基、基因型對愈傷分化影響較大。

2.2.2 再生苗生根培養(yǎng)及移栽

待叢生芽幼苗長到3～5 cm 時，剪去假根，并將其轉(zhuǎn)接到1/2MS生根培養(yǎng)基上，待長3～4條根時，將瓶蓋打開適應(yīng)1～2 d后，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽到含蛭石和營養(yǎng)土的盆中生長14～21 d，其間通過澆營養(yǎng)液來維持植株生長所需營養(yǎng)物質(zhì)，然后移栽到溫室生長至植株成熟（圖3）。移栽時注意不傷及根系，并保持營養(yǎng)土濕潤。

3 結(jié)論與討論

幼穗是高粱組織培養(yǎng)中1個重要的外植體，對愈傷組織誘導(dǎo)非常有利，韓福光等的研究認為幼穗也是高粱優(yōu)良的外植體[10-11，34]。本研究取旗葉期7 cm的幼穗為外植體進行組織培養(yǎng)，愈傷誘導(dǎo)率達84%，分化率為11.49%。而石太淵等研究認為3 cm長的幼穗比較適合愈傷組織的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率可達100%[20]，由此可見，幼穗的取材時期對愈傷誘導(dǎo)非常關(guān)鍵。同時本研究在愈傷誘導(dǎo)過程中，發(fā)現(xiàn)2，4-D和KT配合使用的效果比單獨使用2，4-D好，而且基因型對愈傷誘導(dǎo)和分化的影響很大，研究結(jié)果與石太淵等的結(jié)果[35]比較一致。同時本研究利用的MB、MS、NB 3種基本培養(yǎng)基對愈傷誘導(dǎo)的影響差異不顯著，但石太淵等認為MS培養(yǎng)基更適合高粱組織培養(yǎng)[35]。至于光照對愈傷誘導(dǎo)的影響，Van Nguyen等認為愈傷在誘導(dǎo)階段培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)移至低光條件下繼續(xù)培養(yǎng)，有利于愈傷的誘導(dǎo)[22]，同樣本試驗研究也證明光照有利于幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)。

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