桉樹染色體壓片技術優化研究

韓超+徐建民+黃芳芳

摘要：為了探索和優化桉樹染色體壓片技術，獲得收縮度好、分散充分的桉樹染色體顯微鏡觀察圖，對比不同取材時間、不同預處理劑和不同解離方法處理下的染色體壓片效果，得出最優的處理方法為：上午09：00進行取材，以8-羥基喹啉進行預處理4 h，用卡諾氏固定液于4 ℃固定24 h，酶解35 min，卡寶品紅染色10 min，最后在顯微鏡下觀察，可以得到清晰、可計數的染色體。該技術可用于桉樹染色體核型分析和倍性鑒定等細胞生物學層面的研究。

關鍵詞：桉樹；染色體；壓片；優化

中圖分類號： Q94-336 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0233-03

染色體的數目、形態是物種顯著的遺傳性特征，可用于鑒別或輔助性鑒別物種、物種間的親緣關系和物種的變異程度[1]。掌握染色體壓片和技術，進行染色體的數量和形態觀察是一項基本的和基礎性的細胞生物學研究技術和手段，這種技術在物種鑒定和鑒別、物種間親緣關系確定、物種倍性鑒定和雜交育種等研究中有廣泛的應用。

桉樹是桃金娘科（Mytraceae）杯果木屬（Angophora）、傘房屬（Corymbia）和桉屬（Eucalyptus）樹種的統稱[2]。桉樹是一種外來樹種，現在對其研究主要集中在雜交育種、優良無性系選育、分子育種及生態效應等相關方面[3-6]，對其細胞層面的研究較少。國外曾有人做過不同種桉樹染色體的觀察研究[7]，但國內只有零星的研究，從研究報道看，還是沒有掌握成熟、穩定和高質量的染色體壓片技術。如果能夠開發出該物種成熟、穩定的染色體壓片技術，則可為開展桉樹種間鑒別、倍性鑒定（筆者正在從事桉樹四倍體誘導研究）和種間親緣關系確定提供必要的技術支持。

本研究以桉樹尾巨桉無性系DH32-29的二倍體和四倍體組培生根苗為研究對象，進行染色體壓片技術觀察，并在預處理、染色和壓片環節進行探索試驗，最終建立了一套成熟穩定的染色體壓片技術體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為尾巨桉（Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis）無性系DH32-29的二倍體和四倍體組培生根苗的根尖，試驗材料于2015年在中國林業科學研究院熱帶林業研究所組培室內經過增殖和生根誘導獲得。

試驗試劑：8-羥基喹啉、秋水仙素、對二氯苯溶液、卡諾氏固定液、鹽酸、纖維素酶、果膠酶和卡寶品紅等。

試驗器材：培養皿、乙醇燈、顯微鏡（徠卡，型號DM4000）、載玻片、蓋玻片、吸水紙、香柏油、石蠟、鑷子和解剖針等。

1.2 試驗方法

取生根培養基中培養的無性系DH32-29生根小苗，不定根著生5～8 d后，將其洗凈，依次進行取材時間、預處理、固定（卡諾氏固定液低溫固定24 h）、解離、染色和壓片處理，1 000倍顯微鏡下觀察，拍照。在前期預試驗基礎上設計不同處理組合。

1.2.1 取材時間

以2 h為間隔進行取材，取材時間為 08：00、10：00、12：00、14：00、16：00、18：00。在這6個時間點獲得的壓片效果的基礎上，進一步細化時間間隔，設置取材時間間隔為0.5 h。根據上述試驗結果，發現在上午08：00到10：00進行取材效果較好，因此，細化后的取材時間分別為08：00、08：30、09：00、09：30、10：00。

1.2.2 預處理

以0.002 mol/L 8-羥基喹啉、0.1 g/L秋水仙素和飽和對二氯苯溶液為預處理劑，在4 ℃條件下浸泡材料，處理時間分別為3 、4 、5 h。

1.2.3 固定

將經過預處理的材料經蒸餾水漂洗后放到卡諾氏固定液中，于4 ℃固定24 h。

1.2.4 解離方法

從固定液中取出根尖，用蒸餾水漂洗，使用稀鹽酸解離法和混合酶液解離法進行對比。酸解法：1 mol/L 稀鹽酸于60 ℃恒溫水浴鍋中分別解離6、8、10 min。酶解法：10 g/L 纖維素酶 和10 g/L 果膠酶混合液（體積比為1 ∶1）于37 ℃恒溫下分別解離30、35、40 min。

1.2.5 染色

根尖用蒸餾水漂洗后放到卡寶品紅中染色 10 min 左右。可以把根尖放在載玻片上，然后滴半滴卡寶品紅染液，待其半干后，蓋蓋玻片，蓋時從一邊先蓋，慢慢蓋到另一邊，蓋玻片和載玻片之間允許有氣泡。

1.2.6 壓片

夾取1個染色后的根尖置于干凈載玻片上，用刀片把根冠及延長區剪去，滴少量染色液，并蓋上蓋玻片，用橡皮擦輕輕敲打蓋玻片，用吸水紙把多余的染色液吸干。

1.2.7 鏡檢

將壓片置于顯微鏡下觀察，觀察每個根尖所有的視野，以染色體的清晰程度、分散程度以及細胞有絲分裂中期分裂相（處于分裂期的細胞）的多少、染色體的聚縮程度等作為判定制備的染色體效果觀察圖的標準。根據鏡檢結果，確定根尖染色體壓片技術的最佳試驗方案。

2 結果與分析

2.1 預處理對尾巨桉DH32-29染色體壓片制備效果的影響

對材料進行預處理，可阻斷紡錘體的形成，使細胞分裂終止在中期階段，提高中期分裂相的出現頻率。試驗發現預處理時間過短，染色體聚縮不到位，染色體相互交叉和粘連，難以進行染色體分析（圖1-A）；處理時間過長，染色體也會發生粘連，聚縮程度嚴重，不易計數（圖1-B）。綜合染色體聚縮程度、分散程度等多項指標發現，在3個預處理組合中，獲取尾巨桉DH32-29染色體標本效果最好的是8-羥基喹啉處理4 h（圖1-C），染色體聚縮程度合適、分散均勻，秋水仙素效果次之，最差的是飽和對二氯苯溶液。

2.2 解離方法對尾巨桉DH32-29染色體壓片效果的影響

酸解法和酶解法都可使尾巨桉DH32-29根尖完全解離。鹽酸在低溫條件下對材料解離的時間把握難度較大，容易出現解離過度問題。而混合酶液解離法在材料解離合適時，細胞分散，細胞中染色體也分散，便于計數；若酶解不足（圖2-A），染色體不易分散和上色；若解離過度（圖2-B），染色體被分解，無法觀察到成形的染色體。因此，從操作的便利度及成本考慮，以纖維素酶和果膠酶混合溶液于37 ℃恒溫解離35 min為佳（圖2-C）。

在給染色體染色過程中，細胞的邊界也變得更加清晰，且壓片過程中仍然保留了細胞邊界的清晰度和完整性，從而能夠看到細胞的大小。如圖3所示，桉樹四倍體細胞（圖3-B）比二倍體細胞（圖3-A）大，前者大小是后者的2倍左右。

如圖4所示，桉樹作為木本植物，壓片時需要用力平衡且力度足夠，否則，容易出現壓片時制片過厚，顯微鏡觀察時同一個焦點無法看清全部，不能在一個清晰的視野內看清染色體全貌，需要多次聚焦才能觀察染色體全貌，這樣就無法一次性成圖。

2.3 取材時間對尾巨桉DH32-29染色體壓片效果的影響

設置的8個時間點，在08：00和10：00可觀察到較多的分裂中期相，而在12：00、14：00、16：00、18：00觀察到的分裂中期相較少。然后，在08：00和10：00之間，觀察時間點細分為每隔30 min觀測1次，發現一般情況下，09：00時分裂中期相較多。但最佳的取材時間并不具有較好的穩定性，有時會發生偏移，且在最佳取材時間獲得分裂中期染色體的比例也有較大波動，可獲得分裂中期相染色體細胞占總細胞數比例在10%～20%之間。

利用本研究優化的壓片技術獲得了不同倍性的染色體顯微鏡觀察圖（圖5），加倍獲得的八倍體，有88條染色體，但仍然實現了充分的收縮和分布上的分散，能夠使用染色體核型分析軟件進行計數和核型分析，這也驗證了本研究摸索出的方法的可靠性和成熟性。

3 討論與結論

本研究結果表明，在09：00取根尖獲得的分裂中期相的細胞數比例較高，雖然具體比例有較大波動性，但這個時間點分裂中期相比例高且保持了穩定性，說明桉樹根尖細胞有絲分裂在24 h的循環周期下具有一定的周期性和穩定性。因此，上午09：00是較合適的取材時間點。

要從桉樹這種木本植物的細胞中獲得清晰的分裂中期染色體圖像，預處理是關鍵步驟之一。預處理可抑制紡錘體的形成，以積累更多的分裂中期相，同時，可使染色體縮短，便于染色體分散和計數[8-9]。據報道，預處理以4 ℃左右低溫處理3～5 h 為宜[10-11]。本研究發現用8-羥基喹啉4 ℃預處理4 h，是制備效果較好的尾巨桉DH32-29染色體的關鍵。處理時間過短，不僅積累停留在分裂中期相的細胞數量少，而且染色體收縮程度差，染色體個體之間分辨界限不明顯，計數難度大；而處理時間過長，染色體收縮程度過大，由短棒狀變為紐扣狀，染色體間形態差異趨于模糊甚至消失，不利于核型分析和觀測染色體形態。

酸解雖然也能夠使細胞壁軟化，但解離效果不如酶解。推測原因，可能是桉樹根尖較堅硬，因此，解離時需要輔助酶來處理。有研究認為，解離的時間控制非常重要[12]。本研究也發現，30、35、40 min之間，相差5 min的解離效果也有很大差異。因此，通過細分解離時間，確定適宜的解離時間，對于獲得理想的解離效果具有重要意義。

壓片效果要求的2個要點：（1）染色體充分收縮，呈短棒狀；（2）染色體充分分散，能較容易實現計數和核型分析。與其他研究[13-18]相比，桉樹是較難獲得高質量染色體顯微鏡觀察圖的樹種。從國內已有的研究成果看，雖然譚德冠等均進行了桉樹染色體壓片觀察的研究[19-21]，但是，從染色體顯微鏡觀察圖來看，未能很好地達到染色壓片所要求的2個標準。本研究經過不斷摸索和優化試驗條件，獲得了較高質量的染色體顯微鏡觀察圖。

本研究獲得的染色體壓片技術優化的經驗有：（1）預處理和解離時需要設定足夠多梯度，從而摸索出最優的試驗條件；（2）把握準確的取材處理時間，至少對部分物種是有很大價值的；（3）酶解比酸解在處理難解離材料時，更具有優勢。

參考文獻：

[1]李懋學，張敩方. 植物染色體研究技術[M]. 哈爾濱：東北林業大學出版社，1991：1-20.

[2]王豁然. 桉樹生物學概論[M]. 北京：科學出版社，2010.

[3]黃崇輝，楊朝輝，陳文平，等. 桉樹雜交育種技術在雷州林業局的應用[J]. 桉樹科技，2008，25（2）：55-60.

[4]張 磊，熊 濤，王建忠，等. 廣西東門林場桉樹無性系選育研究概述[J]. 桉樹科技，2015，32（1）：45-49.

[5]歐陽樂軍，曾富華. 桉樹分子育種研究進展[J]. 分子植物育種，2008，6（6）：1146-1152.

[6]徐大平，張寧南. 桉樹人工林生態效應研究進展[J]. 廣西林業科學，2006，35（4）：179-187.

[7]Oudjehih B，Abdellah B. Chromosome numbers of the 59 species of Eucalyptus LHerit. （Myrtaceae）[J]. Caryologia，2006，59（3）：207-212.

[8]張永兵，陳勁楓，伊鴻平，等. 甜瓜有絲分裂染色體制片技術及核型分析[J]. 西北植物學報，2005，25（9）：1735-1739.

[9]王小蓉，湯浩茹，李 玲，等. 根尖壓片法制備樹莓染色體標本的研究[J]. 四川農業大學學報，2007，25（3）：277-281.

[10]陳瑞陽. 中國主要經濟植物染色體圖譜：第一冊——中國果樹及其野生近緣植物染色體圖譜[M]. 北京：萬國學術出版社，1993：263-279.

[11]丁 鴻，邱東萍，陳少雄. 植物染色體標本的制備和染色體核型分析研究進展[J]. 南方農業學報，2012，43（12）：1958-1962.

[12]張 羽，王 勇，陳雪燕. 植物染色體制片中疑難問題的解析[J]. 安徽農業科學，2010，38（35）：19901-19903.

[13]王 芳，周蘭英. 兩種榕屬植物的染色體核型分析[J]. 西北植物學報，2011，31（9）：1749-1752.

[14]郭媛媛，邢世巖，馬穎敏，等. 15種榛子種質的染色體核型分析[J]. 園藝學報，2009，36（1）：27-32.

[15]杜 培，張新友，李麗娜，等. 高質量花生根尖細胞染色體制片方法研究[J]. 河南農業科學，2013，42（3）：31-35.

[16]李永泉，陳清鳳，張應中，等. 廣寧紅花油茶根尖壓片制作技術[J]. 廣東林業科技，2012，28（2）：22-25.

[17]徐道娜，薛志強，李世棟，等. 西瓜染色體壓片技術改進研究[J]. 西北農業學報，2007，16（6）：301-304.

[18]高和瓊，王 英，金 鴿，等. 橡膠樹葉片染色體制片方法的優化[J]. 熱帶作物學報，2009，30（5）：565-569.

[19]譚德冠. 剛果12號桉（Eucalyptus 12ABL）組織培養及多倍體誘導的研究[D]. 廣州：華南熱帶農業大學，2004.

[20]李守嶺，莊南生，王 英，等. 剛果12號桉胚乳愈傷組織誘導和三倍體植株再生研究[J]. 西北林學院學報，2008，23（3）：101-104.

[21]王以紅，胡洲鶴，吳幼媚. 桉樹染色體的染色和制片技術[J]. 廣西林業科學，2004，33（4）：177-179.