多花黑麥草葉蛋白提取及純化工藝研究

劉俊利+許能祥+董臣飛

摘要：為探索多花黑麥草葉蛋白提取及純化工藝，采用不同的料水比、pH值和絮凝溫度進行多花黑麥草葉蛋白的提取和選用不同純化劑進行葉蛋白純化研究，結果表明，使用酸性熱提法提取葉蛋白效果最好。最佳提取條件為pH值為4.0，70 ℃水浴加熱10 min，葉蛋白提取率、純蛋白含量均達到最大值，分別達46.17%和53.13%。多花黑麥草葉蛋白的最佳純化試劑為醇類物質，葉蛋白純度提高6%～7.5%，綜合考慮成本、安全等因素，推薦使用乙醇作為葉蛋白的純化劑。

關鍵詞：多花黑麥草；葉蛋白；提?。患兓?/p>

中圖分類號： S816.4 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0343-03

隨著社會的不斷發展，人均畜產品需求持續增長，飼料糧的供給不足已經成為當前糧食安全的主要問題之一[1-2]。我國畜牧生產和淡水養殖業蛋白質飼料缺口很大，開發并利用植物蛋白資源對緩解養殖業蛋白資源缺乏具有重要作用[3-6]。多花黑麥草（Lolium multiflorum）為我國長江中下游及其以南地區的重要冷季牧草，具有產量高、品質好、耐濕等優點，是飼養家畜及草食性魚類的優質飼料，目前主要用作鮮飼和青貯，但由于多花黑麥草供草期集中，短時間內供過于求的現象時有發生，而利用多花黑麥草進行深度開發利用較少[7-10]。多花黑麥草粗蛋白含量高，利用多花黑麥草生產葉蛋白，對緩解我國蛋白飼料嚴重短缺有重要意義。本試驗以初穗期多花黑麥草為試驗材料，進行葉蛋白的提取工藝優化研究，并對葉蛋白的純化進行了初步研究，以期為多花黑麥草葉蛋白的高效提取及利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自江蘇省農業科學院六合種養偱環基地初穗期的多花黑麥草，多花黑麥草品種為長江2號。

1.2 多花黑麥草葉蛋白提取

1.2.1 原料前處理

稱取多花黑麥草整株100 g，清洗，剪成長1～2 cm的小段，按試驗設計的料水比加入規定量的水，打漿機打漿后，用3層紗布過濾，收集濾液，濾渣用蒸餾水洗滌2次，棄濾渣后得到的濾液即為含有多花黑麥草葉蛋白的汁液。

1.2.2 調pH值 使用HCl調節多花黑麥草汁液的pH值至設定的pH值。

1.2.3 加熱 采用恒溫水浴加熱的方法將多花黑麥草汁液加熱到設定的溫度，在水浴鍋內恒溫一定的時間得到絮凝物。

1.2.4 冷卻離心 冷卻到室溫后裝入離心管內，8 000 r/min離心7 min，去上清得到多花黑麥草葉蛋白濃縮物。

1.2.5 干燥 采用55 ℃恒溫干燥法對多花黑麥草葉蛋白濃縮物進行干燥，烘干24 h至恒質量。

1.3 多花黑麥草葉蛋白提取工藝的優化

1.3.1 料水比對葉蛋白提取的影響 稱取新鮮多花黑麥草3份，按鮮葉與水的重量比例1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4（g ∶mL）分別加水，打漿、過濾，將pH值調到4，70 ℃加熱10 min，重復3次。

1.3.2 pH值對葉蛋白提取的影響 稱取新鮮多花黑麥草5份，按料水比1 g ∶3 mL加水，打漿、過濾，分別將pH值調到2、4、6、8、10，70 ℃加熱10 min，重復3次。

1.3.3 絮凝溫度對葉蛋白提取的影響 稱取新鮮多花黑麥草4份，按料水比1 g ∶3 mL加水，打漿、過濾，將pH值調到4，分別在40、50、60、70、80 ℃下加熱10 min，重復3次。

1.3.4 絮凝時間對葉蛋白提取的影響 稱取新鮮多花黑麥草4份，按料水比1 g ∶3 mL加水，打漿、過濾，將pH值調到4，70 ℃ 分別加熱5、10、15、20 min，重復3次。

1.3.5 提取工藝的優化 選取料水比、pH值、絮凝溫度3個因素，設計3個水平正交試驗因子的水平表（表1），按照標準正交表L9（33）進行試驗。

1.4 葉蛋白純化

分別使用甲醇、無水乙醇、丙酮、四氯化碳、異丙醇、蒸餾水等試劑以料水比1 g ∶3 mL浸洗新鮮提取的葉蛋白粗提物，靜置12 h，3 000 r/min離心10 min，去上清，沉淀烘干后測定其純化蛋白質含量。重復3次。

1.5 計算方法

葉蛋白得率=葉蛋白干質量多花黑麥草樣品鮮質量×100%；

葉蛋白提取率=葉蛋白干質量×粗蛋白含量鮮樣烘干后干基質量×干基蛋白含量×100%。

1.6 數據分析

利用Microsoft Excel 2007進行數據處理，采用SPSS Statistics 17.0統計軟件中的ANOVA程序進行Duncans多重比較分析，不同指標的平均值通過SAS 9.2 軟件采用Fishers LSD法進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 多花黑麥草葉蛋白提取工藝的研究

2.1.1 料水比對葉蛋白提取的影響 不同料水比提取葉蛋白的試驗結果（表2）表明，隨著料水比的提高，提取物中蛋白質的含量也逐漸增高，當料水比為1 g ∶3 mL時，蛋白質含量達到最高，之后呈降低趨勢；而葉蛋白提取率和蛋白質的含量呈相關關系，在料水比為1 g ∶3 mL時，葉蛋白的提取率最高，為45.39%，顯著高于料水比為1 g ∶4 mL的提取率（41.77%），但料水比為1 g ∶2 mL和1 g ∶3 mL的葉蛋白提取率差異不顯著。

2.1.2 pH值對葉蛋白提取的影響

不同的pH值條件下，蛋白質含量與葉蛋白提取率差異均達到顯著和極顯著水平。當pH值從2增加到4時，蛋白質含量與葉蛋白提取率均達到最高，分別為52.08%和45.95%，顯著高于pH值為2時的46.82%和39.92%；當pH值逐漸增大，溶液由酸性變為中性至堿性時，蛋白沉淀量與提取率迅速下降，堿性越大，蛋白含量與提取率越低（表3）。

2.1.3 絮凝溫度對葉蛋白提取的影響

絮凝溫度升到 50 ℃，多花黑麥草中葉蛋白開始絮凝沉淀，蛋白沉淀量隨著溫度的升高而逐漸增加，并最終趨于平穩（表4）。由表4可見，當溫度由60 ℃升到70 ℃時，多花黑麥草蛋白質含量逐漸增大，從70 ℃升到80 ℃時，蛋白質含量下降，可見由60 ℃到80 ℃，蛋白質含量先增大后降低，70 ℃時的蛋白質含量（52.39%）顯著高于其他溫度；而從葉蛋白提取率來看，隨著溫度的逐漸升高，提取率一直呈增加狀態，但增加速度逐漸趨于平緩。綜上可知，70 ℃是提取葉蛋白的最佳絮凝溫度。

2.1.4 絮凝時間對葉蛋白提取的影響

在料水比 1 g ∶3 mL，pH值為4，70 ℃的絮凝溫度下，將多花黑麥草汁液分別加熱不等的時間。由表5可以看出，絮凝時間對多花黑麥草葉蛋白提取的影響較小。加熱5 min與加熱10 min蛋白質含量與葉蛋白提取率都較高，相比之下加熱10 min效果更好，提取率（45.97%）最高。

2.1.5 多花黑麥草葉蛋白提取工藝的優化

正交試驗結果（表6）顯示，各因素對蛋白質含量與葉蛋白提取率都有顯著影響。按照極差R的大小，影響多花黑麥草中蛋白質含量因素的大小順序為C>B>A，即絮凝溫度>pH值>料水比；影響多花黑麥草中葉蛋白提取率因素的大小順序為B>A>C，即pH值>料水比>絮凝溫度。表中計算分析后的最佳組合條件為A2B2C3，在料水比為1 g ∶3 mL、pH值為4、絮凝溫度 70 ℃ 的條件下，蛋白質含量53.13%，葉蛋白提取率 46.17%，2項指標均為最高值。

2.2 多花黑麥草葉蛋白的純化

分別用甲醇、無水乙醇、丙酮、四氯化碳、異丙醇、蒸餾水等試劑對新鮮提取的多花黑麥草葉蛋白粗提物進行萃取純化。試驗結果（圖1）表明，當未使用純化劑時，對照組中多花黑麥草葉蛋白的蛋白純度在56%左右；使用純化劑后，在各種純化劑作用下葉蛋白的蛋白純度均有所上升，影響大小依次為丙酮>乙醇 >甲醇>異丙醇>四氯化碳>水。其中丙酮的純化效果最好，蛋白質純度達到67%；乙醇次之，為64%；水的效果最差，僅為57%，而甲醇、異丙酮及四氯化碳之間差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

3.1 多花黑麥草葉蛋白提取工藝

試驗中，當料水比達到1 g ∶3 mL、pH值為4、絮凝溫度為 70 ℃、絮凝時間為10 min時，提取物中蛋白質含量最高為 53.13%，且葉蛋白提取率也最高，為46.17%。從料水比來看，打漿過程中，加水量太少，使得多花黑麥草鮮樣浸泡不充分，打漿不徹底，葉蛋白不能充分提取；隨著加水量增多，雖然樣品中葉蛋白得到充分浸泡與提取，但是同樣會溶解較多的細小纖維與色素，加熱過程中蛋白不能完全絮凝沉淀，仍溶解在濾液中，造成提取率下降。

蛋白質是一種兩性電解質，當蛋白質所處環境pH值發生改變時，其表面的電荷量會隨著溶液pH值的改變而發生相應的變化。在多花黑麥草葉蛋白提取過程中，提取液pH值為4時蛋白絮凝沉淀量最大且葉蛋白提取率最高，表明多花黑麥草葉蛋白呈酸性。

溫度是影響蛋白質含量的重要因素。絮凝溫度在50～80 ℃范圍內，隨溫度的升高，多花黑麥草葉蛋白的提取率也隨之增加，并逐漸緩和，因為葉蛋白不但受加熱變性的影響，同時還要受等電點沉淀因素的作用，蛋白凝聚機會和敏感性得以增加，從而使葉蛋白凝聚速度加快，絮凝出的物質結構緊密且易分離，保證了葉蛋白的高提取率。隨著絮凝時間的延長，蛋白質含量與葉蛋白提取率變化相差不大，并不隨時間的延長而增加，這說明絮凝時間并不是影響多花黑麥草葉蛋白提取的主要因素。

從選取影響葉蛋白提取的衡量指標來看，大部分類似的試驗主要考慮葉蛋白得率，但是由于葉蛋白中粗蛋白含量會隨著試驗參數的改變而發生較大的變化，所以蛋白質含量這一指標不能準確且全面地反映從多花黑麥草中提取的蛋白質情況，同理，葉蛋白得率也是如此，為彌補此項不足，通過增加葉蛋白提取率來補充反映蛋白質的提取情況。本試驗在多花黑麥草葉蛋白提取工藝的優化中，綜合考慮蛋白質含量與葉蛋白提取率2項指標的結果，同時兼顧生產成本及絮凝時間，選擇料水比1 g ∶3 mL、pH值4、絮凝溫度70 ℃、絮凝時間 10 min 為最佳試驗條件，在該條件下，蛋白質含量與葉蛋白提取率均可達到最高值，該結果與楊朝英等報道的試驗結果[11]相一致。

3.2 多花黑麥草葉蛋白的純化

鮮樣中提取的多花黑麥草葉蛋白，由于其中含有多種植物色素如葉綠素、類胡蘿卜素，類脂化合物以及能夠導致不良氣味及顏色的多酚類物質，對其利用有不利影響，而通過使用有機溶劑進行純化，不但除去了這些不良物質，還提高了葉蛋白的純度[12-13]。本試驗通過使用各種有機溶劑，提高葉蛋白純度百分點左右，純化后的多花黑麥草葉蛋白顏色變淺，無異味，蛋白質含量明顯升高。而采用水進行純化效果最差，因為葉綠素類物質不溶于水中；采用丙酮的純化效果最好，但是丙酮具有強的刺激性，且易燃易爆，因此，不推薦丙酮作為純化劑大量使用；醇類效果也較好，其中乙醇作為純化劑，不但可除去植物色素、類脂化合物及多酚類化合物，而且其成本較低、對人體無毒、易于回收，因此，推薦使用乙醇作為葉蛋白的純化劑。

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