糖酵解中間產(chǎn)物磷酸丙糖鑒定實驗課的研究性教學(xué)

楊生妹+魏萬紅+陳云

摘要：本文研究以學(xué)生為主體，促進(jìn)學(xué)生自主學(xué)習(xí)的教學(xué)方式，設(shè)計新的實驗方案，使學(xué)生更細(xì)致地觀察實驗現(xiàn)象，深入了解實驗原理，鞏固已學(xué)基本知識，拓展背景知識。

關(guān)鍵詞：糖酵解；磷酸丙糖鑒定；研究性教學(xué)

中圖分類號：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）51-0265-02

糖酵解途是存在于所有生物體中的非常保守的代謝途徑，因而該途徑成為動態(tài)生物化學(xué)部分最重要的教學(xué)內(nèi)容。與此相匹配的實驗課教學(xué)內(nèi)容糖酵解中間產(chǎn)物磷酸丙糖的鑒定，因為涉及到有機(jī)化學(xué)課程中糖的顏色反應(yīng)、生物化學(xué)課程酶的活性中心、必需基團(tuán)、抑制劑及蛋白質(zhì)變性劑等內(nèi)容而成為一個操作相對容易但涉及面很多的實驗。因此選定此實驗內(nèi)容作為研究性教學(xué)，既可以鞏固很多已學(xué)的基礎(chǔ)知識，也有利于開闊新的視野。現(xiàn)將該實驗課研究性教學(xué)的過程、特點、意義及學(xué)生收獲總結(jié)如下。

一、教學(xué)過程及特點

1.選定實驗內(nèi)容，學(xué)生分派任務(wù)。因為研究性教學(xué)強(qiáng)調(diào)調(diào)動學(xué)生的主觀能動性[1]，所有學(xué)生所做的實驗相同，但分別負(fù)責(zé)不同實驗結(jié)果及原理的介紹及解釋。

2.進(jìn)行新的實驗設(shè)計，細(xì)化實驗現(xiàn)象，深化實驗原理。在原先的講義中[2]，實驗共分三個組（表，原1、原2及原3）。實驗步驟為：取干酵母粉約2g于燒杯中，加10ml去離子水，用玻棒攪勻，使其成為混懸液，并嚴(yán)格依次添加試劑（表）。充分反應(yīng)后，用2，4-二硝基苯肼使丙糖顯色。

在本次教學(xué)過程中，實驗進(jìn)行了新的分組（表，新1-5）。從表中可以看出，新的實驗設(shè)計比原先多了兩個組，其實就是將原先的第一組（原1）分成了三個組（新1、新2及新3）。新4同原2，新5同原3。

3.在實驗結(jié)束后，每組派代表進(jìn)行匯報，所有同學(xué)進(jìn)行討論。

二、教學(xué)意義及學(xué)生收獲

1.拓展背景知識，了解研究意義。匯報階段，第一組代表回顧糖酵解途徑的發(fā)現(xiàn)史、講解糖酵解的關(guān)鍵步驟。由于所選教科書的內(nèi)容及課時數(shù)限定[3]、在理論課上，學(xué)生們無緣學(xué)習(xí)糖酵解的發(fā)現(xiàn)史。此次活動不僅讓他們彌補(bǔ)了這方面的不足，也了解了人們對酶及酶促反應(yīng)本質(zhì)的認(rèn)識過程。因為在該途徑闡明前，人們認(rèn)為物質(zhì)發(fā)酵必須是整個活細(xì)胞的作用。1897年有人發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞榨取汁可以使蔗糖發(fā)酵，使人們認(rèn)識到發(fā)酵是細(xì)胞中特定物質(zhì)的作用，從而真正開始了酶的研究[4]。第一個同學(xué)還給大家匯報了糖酵解途徑與癌癥治療的相關(guān)研究進(jìn)展，即抑制糖酵解途徑關(guān)鍵酶的作用，會有效抑制癌細(xì)胞的增殖[5，6]。此外，第一組同學(xué)代表展示了第一組實驗結(jié)果。第一組反應(yīng)試管中僅加入了酵母菌和葡萄糖，該實驗的目的是證明如果不采取其他措施，酵母菌因含有糖酵解所需的所有酶、輔助因子及金屬離子，在反應(yīng)足夠時間后，可以使所有的葡萄糖被酵解。因此反應(yīng)結(jié)束，該管中不應(yīng)有丙糖。原先的實驗中無此設(shè)計，加入新的設(shè)計，以觀察既沒有丙糖，也沒有葡萄糖時的實驗現(xiàn)象。

第二組試管中，加入酵母菌后，馬上加入三氯乙酸，使所有的酶和蛋白質(zhì)變性，從而使試管中后加入的葡萄糖根本沒有被酵解。

第二組同學(xué)代表先給大家比較了第一組和第二組的結(jié)果，盡管兩組的實驗現(xiàn)象并無不同，即加入2，4-二硝基苯肼后都沒有觀察到丙糖的存在，但兩組實驗的原理大相徑庭，第一組有糖酵解，第二組無糖酵解。二組代表不僅回顧了理論課上講過的蛋白質(zhì)的變性現(xiàn)象及原理，也告訴同學(xué)們理論課上沒涉及到的三氯乙酸作為變性劑的機(jī)制：在酸性條件下，三氯乙酸可以與蛋白質(zhì)形成不溶性的鹽，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。

第三組試管中加入的是酵母菌、一碘乙酸及葡萄糖。第三組的同學(xué)代表講解了酶抑制劑的分類及各自的作用原理。糖酵解途徑中，磷酸甘油醛脫氫酶是有巰基的酶，一碘乙酸以與酶活性中心的巰基結(jié)合，作為酶的不可逆抑制劑使酶活性受到抑制，從而使酵解反應(yīng)停止在3-磷酸甘油醛水平。按理說這組試管中能看到很多丙糖的存在，但實驗結(jié)束后并沒有觀察到預(yù)期現(xiàn)象。

第四組試管比第三組試管多加了硫酸肼。這組試管中有大量的磷酸丙糖積累。第四組同學(xué)代表首先讓大家注意在糖酵解反應(yīng)過程中，從1，6-二磷酸果糖到3-磷酸甘油醛的產(chǎn)生都是可逆過程，因此盡管第三組的試管中加入了酶抑制劑，使反應(yīng)停止在3-磷酸甘油醛階段，但由于可逆步驟中間產(chǎn)物間建立平衡，因而第三組試管中無太多的甘油醛積累。另外在反應(yīng)體系中，有可能存在其他的氧化劑，它們也有可能使磷酸甘油醛被氧化。第四組同學(xué)通過查找其他教科書認(rèn)識到硫酸肼具強(qiáng)還原性[7]。因此，硫酸肼第一可還原試管中其他的氧化劑，減弱它們對磷酸甘油醛的氧化；第二可還原已被氧化的磷酸甘油醛，這就很好地解釋為什么在第四組試管中磷酸甘油醛能夠大量積累。新的實驗方案對認(rèn)識硫酸肼的作用原理有重要意義，使學(xué)生認(rèn)識到實驗設(shè)計需要綜合多方面的知識，巧妙設(shè)計才能更好地觀察到需要觀察的現(xiàn)象。

第五組試管中加入的是酵母菌、氟化鈉及葡萄糖。氟化鈉是烯醇化酶的抑制劑，它使糖酵解反應(yīng)停止在2-磷酸甘油酸的階段。但由于在此之前有很多可逆步驟，這些步驟的產(chǎn)物之間也存在平衡，因此這組試管中也存在少量的磷酸甘油醛。這組實驗使學(xué)生加深了對糖酵解各步驟性質(zhì)的了解。第五組同學(xué)代表的拓展講解又使他們了解到氟化鈉的抑制作用與鎂有關(guān)，鎂為烯醇化酶的輔基，而氟會與鎂結(jié)合，取代鎂與烯醇化酶的結(jié)合，這一過程也使學(xué)生鞏固了酶的輔助因子的概念及非專一性不可逆酶抑制劑的概念。

2.提高主觀能動性，質(zhì)疑講解內(nèi)容并尋求解決方案。匯報結(jié)束后同學(xué)們進(jìn)行了熱烈討論，并提出很多不同見解。有同學(xué)提問，為什么抑制糖酵解途徑可以影響癌細(xì)胞的生長？負(fù)責(zé)同學(xué)回答：因為癌細(xì)胞生長迅速，所以癌細(xì)胞處于相對缺氧的環(huán)境，細(xì)胞主要靠糖的無氧酵解供能[6]，另外即使在氧供充足的條件下，癌細(xì)胞也主要通過糖酵解途徑獲得能量，這一現(xiàn)象被稱為“Warburg效應(yīng)”[8]。這一機(jī)制為我們診斷治療癌癥提供了思路和途徑。有同學(xué)接著提問，抑制糖酵解途徑對正常細(xì)胞有沒有影響？同學(xué)代表回答，正常細(xì)胞可以通過其他的有氧供能途徑得到能量。

觀摩活動的老師提出，除了用2，4-二硝基苯肼使糖顯色，有沒有更特異的鑒定方法。被提問的同學(xué)回答，用薄層層析法，不同的糖層析時的遷移率不同，可以鑒定出具體的糖[9]。

綜上所述，通過本次實驗操作及講述，大家對變性劑與抑制劑及有了感性認(rèn)識；對利用抑制劑鑒定代謝途徑的中間產(chǎn)物的原理，對酶的活性基團(tuán)的概念的理解也較原來深刻許多；糖酵解途徑在臨床方面的應(yīng)用激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣及積極性；同學(xué)間的分工及合作加強(qiáng)了他們的團(tuán)隊意識，提高了他們發(fā)現(xiàn)問題解決問題的能力。

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The Research Teaching of the Identification of Phosphotriose，the Intermediate Product of Glycolysis

YANG Sheng-mei，WEI Wan-hong，CHEN Yun

（College of Biological Sciences and Technology，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）

Abstract：In order to promote the enthusiasm of students and push them to get knowledge by themselves，the experiment procedures were redesigned. The results showed that this made students observe the experiment phenomenon in more detail and understand the principle more deeply. And they reviewed the knowledge they studied in classes and mastered new knowledge they had no chance to obtain in classes.

Key words：glycolysis；phosphotriose；research teaching