植物葉綠體遺傳轉化技術及應用研究進展

母連勝，何勇，田志宏 長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025；主要糧食作物產業化

湖北省協同創新中心(長江大學)，湖北 荊州 434025

植物葉綠體遺傳轉化技術及應用研究進展

母連勝，何勇，田志宏 長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025；主要糧食作物產業化

湖北省協同創新中心(長江大學)，湖北 荊州 434025

葉綠體轉化是植物基因工程中的新熱點，葉綠體轉基因通常具有較高表達水平，可以在操縱子中成簇串聯，而且可以有效地防止外源基因的花粉逃逸。最近的研究逐步地擴展了人們對葉綠體基因工程的應用，許多實例表明，質體轉化在作物遺傳改良上有著巨大的潛力，同樣在植物生物反應器的發展上也有巨大作用，可持續且高效益地生產生物醫藥、生物酶以及化工原材料。綜述了葉綠體遺傳轉化技術的最新進展，重點闡述了葉綠體轉化的表達調控及葉綠體轉化技術的應用。

葉綠體轉化；葉綠體基因工程；植物；質體

植物細胞具有3個基因組，并且在一些種子植物中，這些基因組中的2個，即核基因組和質體基因組(葉綠體基因組)是可轉化的。葉綠體基因組主要是長度為120～220kb的共價閉合環狀的雙鏈DNA，編碼120～130個基因[1]。目前，已有多種植物成功進行了葉綠體轉化，這種可能性已經引起了人們極大的興趣，因而質體基因組相對于核基因組具有更大的吸引力。首先，每個細胞有大量的葉綠體，每個葉綠體基因組有很高的拷貝數，可使外源基因達到非常高的表達水平，通常高于核基因組1到2個數量級[2,3]。其次，通過同源重組，可使外源基因定點整合到質體基因組中，葉綠體基因工程成為植物高度精確的遺傳工程技術(通常通過非同源重組整合外源DNA進入核基因組)。第三，作為來源于通過內共生獲得的藍細菌的原核系統，質體遺傳系統缺乏基因沉默和干擾穩定轉基因表達的其他表觀遺傳機制。第四，類似于細菌基因，許多質體基因排列在操縱子中，具有通過將它們排列在人工操縱子中成簇串聯轉基因的可能性。最后，由于在大多數被子植物物種中，葉綠體是母性遺傳，其大大降低了花粉的傳播，從而較好抑制基因逃逸[4,5]，所以質體轉化已經作為用于轉基因抑制的有效工具，從而受到了極大的關注[6,7]。

自Boynton等[8]和Svab等[9]分別在1988年和1990年完成了萊茵衣藻和煙草葉綠體的遺傳轉化以來，葉綠體基因工程發展迅速，促進了其他植物葉綠體的轉化。但目前葉綠體轉化仍然限于相對少量的植物，且不僅僅是單子葉植物(包括代表世界上最重要主食的糧食作物)。因此，在葉綠體轉化技術方面仍然面臨著嚴峻的挑戰，要做出突破，需要繼續努力探究。為此，筆者對葉綠體轉化技術的研究進展及其應用進行了綜述。

1 葉綠體轉化技術與過程

1.1 葉綠體轉化方法

過去二十多年以來，葉綠體轉化的基本方法沒有改變。基因槍介導轉化[10]仍然是主要的轉化方法，聚乙二醇(PEG)介導[11]的原生質體轉化偶爾替代使用[12]。相比較于基因槍法，PEG介導的葉綠體轉化技術要求高，費力更費時，但是該方法具有的優點是不受專利保護，不依賴于組織培養方法的葉綠體轉化技術(農桿菌侵染)更能被廣泛應用。最近，在溫室生長的煙草臺葉綠體轉化技術已經取得了一些進展，特別是利用靶向質體的噬菌體衍生的重組酶的位點特異性重組轉移去除標記基因[13]。通過注射根癌農桿菌將重組酶導入到土壤中生長的煙草腋芽中，在切掉芽尖后，從注入的腋生分生組織側枝常常形成具有無標記質體基因組的組織，子代中出現7%的無標記質體基因組。盡管該結果表明，通過用基因工程的質體靶向酶的核表達，在植物中至少可以進行質體DNA的一些改進操作，但通過不依賴組織培養方法獲得質體轉化的目標仍然難以實現。

1.2 選擇標記基因

類似于DNA的轉錄程序，在過去的20a里獲得轉基因植株的篩選程序沒有多大變化。壯觀霉素抗性基因aadA編碼氨基葡糖苷-3'-腺苷酰轉移酶(具有壯觀霉素和鏈霉素抗性)[14]仍然是葉綠體轉化中最常用的選擇標記基因[15]。雖然近年來，已經開發了幾種替代的抗生素抗性標記基因[16～18]，它們似乎不如aadA有效，可能是因為它們需要更高的表達水平來賦予表型抗性。盡管如此，當考慮知識產權時，它們可以作為有吸引力的替代品，并且它們還代表有價值的工具用于超轉化。

1.3 葉綠體基因組細胞間轉移

目前葉綠體轉化技術仍然限于相對較少的植物，開發新物種的轉化體系需要大量的工作，用以優化組織培養、再生和篩選過程[19,20]。可用于葉綠體轉化的重要模式植物(包括擬南芥)和農業上重要的主要作物(包括所有糧食作物)仍然缺乏有效體系，有時甚至轉變為密切相關的物種或不同品種之間的轉化都是有挑戰性的[21]。改變建立一個新的轉化方案是將轉基因質體從易于轉化的物種轉移至不易轉化的相關物種或栽培品種，這可以通過應用細胞生物學方法來完成，如原生質體融合，通過在原生質體融合實驗(例如通過X-射線照射)中消除融合配偶體之一的核基因組來產生細胞(或胞質雜合體)。為了將轉基因葉綠體與新核聯合，轉移原生質體的核基因組需要消除，并且在原生質體融合后，在轉基因葉綠體抗性篩選下獲得(野生型)質體與外來物種或品種的轉基因質體的再生植物。這種方法已經被證明有效，但由于原生質體融合和原生質體植株再生過程中費力又耗時的苛刻過程，僅適用于少量的植物物種。

最近，已經開發了在植物之間轉移轉基因質體的更簡單的方法。有個令人驚訝的發現，質體DNA(可能整個質體)可以在嫁接植物的細胞之間遷移[22～24]。由于可以嫁接不相容性的植物，該方法允許通過嫁接位點(在建立嫁接接合后)將轉基因質體轉移到不易轉化植物的細胞中來完成植物之間的質體轉化[25]，這種方法可能有助于擴大葉綠體轉化技術的物種范圍，但其適用性將限于密切相關的植物。核基因組與新質體基因型的組合可能導致所謂的質體基因組不相容性，其隨著系統發生距離的增加變得更可能，并且可能導致嚴重的突變表型[26]。

2 葉綠體轉化的表達調控

2.1 蛋白表達穩定元件

生物技術人員對葉綠體轉化關注的主要原因在于通過從質體基因組表達轉基因可獲得非常高的外源蛋白積累水平，在極端情況下，可超過葉中總可溶性蛋白質的70%[27]。盡管許多情況下可以獲得較高的表達率，但是重要的是要意識到，還有一系列的蛋白質在質體中的表達是有問題的，表達水平低或不可檢測得到。雖然很少系統地研究轉基因不成功表達的分子原因，但從實驗的一些細節分析表明蛋白質穩定性的關鍵通常是限制外來蛋白質的積累[28]。即使相當充分地研究了在質體中的RNA轉錄和穩定性的調節，但是關于控制蛋白質穩定性的規則知之甚少。最近的跨膜系統研究已經揭示了N末端在確定葉綠體蛋白質穩定性中的重要作用。因此，操縱不穩定重組蛋白質的N末端或將它們融合到穩定蛋白質的N末端可以幫助緩解蛋白質穩定性[29]。然而，似乎不可能用不穩定的N末端來解釋所有低外源蛋白積累的情況，內部序列模式或蛋白質的不正確折疊也可能引發蛋白質快速降解。目前不了解蛋白質穩定性的內在決定因素，控制在質體中表達的蛋白質可折疊性的規則也是難以捉摸的。因此，使重組表達的蛋白質穩定性在質體更可預測和如何穩定固有不穩定蛋白質提供指導是未來研究的主要挑戰。

葉綠體轉化技術的另一個吸引力涉及質體基因表達機器的原核性質，它提供了在操縱子中成簇串聯多個轉基因并從單個啟動子作為多順反子mRNA[30]共表達它們的可能性，這對于代謝途徑的工程化(其通常需要多種酶的協同表達)特別有用。盡管在某些情況下操縱子表達已經成功[31]，但是在轉化到葉綠體基因組中的操縱子構建體中還至少存在一些轉基因差異表達的幾個實例[32]。在細菌中，由操縱子制備的多順反子mRNA直接進入翻譯，但葉綠體中的許多多順反子轉錄物必須經歷轉錄后切割成單順反子單位以促進翻譯，特別是操縱子中下游順反子的翻譯。為了確保轉基因操縱子的所有順反子在質體中的可翻譯性，可以包括將順反子加工轉化為穩定的單順反子mRNAs[33]的小序列元件。IEE[34](反順反子表達元件)是源自質體psbB操縱子中的加工位點，該元件為合成操縱子設計提供了有價值的作用，因為其大大增加了葉綠體轉化中操縱子成功表達的機會。

2.2 非綠色組織中基因表達

葉綠體轉化技術在非綠色組織(如水果、塊莖和種子等)中基因表達水平很低。番茄果實和馬鈴薯塊莖中的轉錄和翻譯的全基因組分析揭示，在這些非綠色存儲器官中幾乎所有葉綠體基因的轉錄和翻譯水平明顯下調。有趣的是，雖然一些特殊的基因維持相對較高的mRNA水平但翻譯水平較低(例如番茄中編碼光系統II的D1蛋白的psbA基因)，另一小部分的特殊基因具有較低轉錄水平，但mRNA顯示出較強的結合核糖體活性翻譯(例如番茄中編碼乙酰輔酶A羧化酶亞基的accD基因)。該觀察表明在果實或塊莖中高mRNA積累的基因的啟動子和與多核糖表現出較強結合力的mRNA的50個非翻譯區(50UTR，含有用于調節翻譯起始的順式元件)組合的可能性。實際上，這種混合表達元件的構建可使根、塊莖和果實[35]中的轉基因表達水平得到顯著改善，并且因此為非葉狀組織的葉綠體中的代謝工程和重組蛋白質生產開辟了新的機會。

2.3 誘導調控表達系統

改變質體中重組蛋白質產物的有害影響的策略是應用誘導調控表達系統，可通過核轉基因容易實現，例如乙醇誘導型T7RNA聚合酶基因，其蛋白質產物靶向質體并轉錄束縛于T7啟動子的質體轉基因[36]。由于核轉基因的使用移除了轉基因組技術的控制優勢，因此非常需要開發用于誘導型轉基因表達的質體純系統，提供嚴格控制和高感應速率的高效系統的設計是具有挑戰性的，到目前為止，已經有2種選擇：一是基于細菌lac抑制子和lac操縱子的系統[37]，其中通過用化學誘導物IPTG噴霧或葉浸潤轉錄誘導基因表達；二是合成核糖開關誘導應答于天然化合物茶堿的應用的翻譯[38]。值得一提的是，在轉基因植物中純化重組蛋白質的有效性和減少其成本效益的策略是葉綠體生物技術的重要應用方面。在這一領域的最新進展包括評價一些純化標簽和外源蛋白質成功靶向塑料球，這有助于通過浮選離心簡單的富集重組蛋白。

有時，在葉綠體中轉基因的表達導致嚴重的突變表型，導致延緩的生長，或在極端情況完全阻止自養生長。這可能具有不同的原因，可能是重組表達的蛋白質的酶活性影響葉綠體的代謝過程，外源蛋白質與葉綠體膜的有害相互作用或簡單地由重組蛋白質的極端積累水平施加的高代謝負荷[39]。可以用2種可能的方式來處理轉基因植物表現出極端表型的問題，一種較快的解決方案是在生物反應器中異養或混養植物(或其衍生的細胞培養物)。最近，已經開發了臨時浸漬生物反應器，其有利于從表現出嚴重突變表型并因此難以在土壤中生長的轉基因植物的生物制品的生產。生物反應器中的生物培養需要無菌條件和合成培養基，這使得其生物制品生產成本明顯高于在自養條件下或是溫室中植物的生產成本。然而，生物反應器代表高價值產品(例如昂貴的生物藥物)的可行選擇，其中生物制品生產的額外成本可忽略。此外，生物反應器提供了全部的控制條件，這對于某些產品可能是理想的，并且可簡化轉基因植物的控制條件。

3 葉綠體轉化技術的新應用

葉綠體轉化技術已廣泛用于將抗性基因插入質體基因組中，使植物耐受除草劑或增強抗蟲性[40,41]，表達用于疫苗分子農業中重組蛋白質和工程化代謝途徑[42,43]，開發可能用作除草劑的D-氨基酸的葉綠體抗性基因[44]，以及抗氧化系統的酶的成功表達以增強對非生物脅迫的耐受性。盡管最初亞基疫苗的抗原是轉質體系統技術在分子農業中的主要應用，但在過去的5a中，已經有很多的藥物蛋白質在轉基因質體中表達。這些蛋白質中的一些可以表現出很高的水平表達，比如一些噬菌體衍生的宿主可以提供新一代抗生素。

隨著人類的開發利用和極端天氣的增加，人們對植物在非生物逆境條件下生長和產量提高的要求也在增加，這就要求提高植物耐旱、耐極端溫度和耐鹽的能力[45]。滲透保護劑通過在滲透調節過程中穩定膜和蛋白能有效提高植物的耐鹽和耐旱能力，但大多數植物不能直接利用，通過在植物體內引入編碼滲透保護劑的相關基因顯然是一個可行的辦法。通過質體遺傳轉化在煙草葉綠體基因組中導入編碼阿拉伯糖醇脫氫酶的ArDH基因，Khan等[46]獲得了能正常生長于含350mmol/L NaCl土壤中的轉化植株。Kumar等[15]利用質體轉化技術在胡蘿卜中引入并表達了編碼甜菜堿脫氫酶的BADH基因，發現在含100mmol/L NaCl的培養基上，轉化植株BADH的表達量比非轉化植株提高了50～54倍，有效提高了轉化植株的耐鹽能力。通過增加不飽和脂肪酸含量來增強植物的抗氧化防御能力，或利用大腸桿菌panD基因編碼的L-天冬氨酸脫羧酶將L-天冬氨酸分解為巴拉寧和CO2，可有效提高植物高溫脅迫的耐受性[47]。

工業酶的表達已成為葉綠體生物技術的一個令人興奮的新領域。隨著對可再生能源日益增長的需求，生物燃料酶的生產已經受到特別強烈的關注。研究表明，很多可用于將纖維素產物轉化為可發酵糖的酶可在葉綠體基因組表達出非常高的水平，例如各種纖維素酶[48]，以及木聚糖酶、葡糖苷酶、果膠酸裂解酶和角質酶。這些酶的一些基因取自嗜熱生物，因此具有熱穩定性質，這是用于以工業規模化處理纖維素產物的特別有用的特征。雖然目前對昂貴的木質纖維素產物的熱酸預處理仍然是經濟上可行的纖維素乙醇生產的主要障礙，但具有廉價的降解纖維素和半纖維素的酶是解決方案的重要組成部分。

使用轉基因植物作為生產所謂“綠色化學品”的工廠也越來越受到關注，即化工原材料和積木。最近轉基因煙草生產的聚羥基丁酸酯(PHB)，是一種可再生的生物塑料，其超過18%的干重代表了植物新陳代謝成功定向合成大量新化合物是特別引人注目的例子。PHB的高水平積累影響轉基因植物的生長，但是這個問題可以通過PHB操縱子的誘導表達而有效地解決。

4 展望

經過近年來的不懈研究，葉綠體轉化技術取得了巨大的進步。葉綠體轉化技術作為分子水平上的一種技術手段，為植物基因工程的研究開辟了一個新的方向，但是成為生物技術的常規技術手段還需要一段時間，技術上的不足以及局限還應得到逐步完善。隨著對葉綠體基因工程的進一步探索與研究，葉綠體基因工程將會在作物遺傳改良、工農業及生物反應器等多個方面發揮巨大的作用。具有高水平重組蛋白表達和多基因工程的巨大進展對該技術的商業化具有很大幫助，雖然來自轉基因植物的產品尚未進入市場，特別是在制藥領域，預期葉綠體轉基因的商業市場將很快到來。

[1]張韻潔,李德銖.葉綠體系統發育基因組學的研究進展[J].植物分類與資源學報,2011,33(4):365～375.

[2]Mcbride K E,Svab Z,Schaaf D J,etal.Amplification of a chimericBacillusgene in chloroplasts leads to an extraordinary level of an insecticidal protein in tobacco[J].Bio/technology,1995,13:362～365.

[3]Oey M,Lohse M,Kreikemeyer B,etal.Exhaustion of the chloroplast protein synthesis capacity by massive expression of a highly stable protein antibiotic[J].The Plant Journal,2008,57:436～445.

[4]Bock R.Genetic engineering of the chloroplast:novel tools and new applications[J].Current Opinion in Biotechnology,2014,26:7～13.

[5]Bock R.Engineering plastid genomes:methods,tools,and applications in basic research and biotechnology[J].Annual Review of Plant Biology,2015,66:211～241.

[6]Ruf S,Karcher D,Bock R.Determining the transgene containment level provided by chloroplast transformation[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2007,104:6998～7002.

[7]Thyssen G,Svab Z,Maliga P.Exceptional inheritance of plastids via pollen inNicotianasylvestriswith no detectable paternal mitochondrial DNA in the progeny[J].Plant Journal for Cell & Molecular Biology,2012,72:84～88.

[8]Boynton J E,Gillham N W,Harris E H,etal.Chloroplast transformation inChlamydomonaswith high velocity microprojectiles[J].Science,1988,240:1534～1538.

[9]Svab Z,Hajdukiewicz P,Maliga P.Stable transformation of plastids in higher plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1990,87:8526～8530.

[10]陳英,黃敏仁,王明庥.植物遺傳轉化新技術和新方法[J].中國生物工程雜志,2005,25(9):94～98.

[11]Díaz A H,Koop H U.Nicotianatabacum:PEG-Mediated plastid transformation[A].Maliga P.Chloroplast biotechnology:methods and protocols[C].Totowa,NJ:Humana Press,2014:165～175.

[12]Maliga P.Plastid transformation in higher plants[J].Annu Rev Plant Biol,2004,55:289～313.

[13]Tungsuchat-Huang T,Maliga P.Visual marker and Agrobacterium-delivered recombinase enable the manipulation of the plastid genome in greenhouse-grown tobacco plants[J].The Plant Journal,2012,70:717～725.

[14]Svab Z,Harper E C,Jones J D,etal.Aminoglycoside-3″-adenyltransferase confers resistance to spectinomycin and streptomycin inNicotianatabacum[J].Plant Molecular Biology,1990,14:197～205.

[15]李軼女,孫丙耀,蘇寧,等.水稻葉綠體表達體系的建立及抗PPT葉綠體轉化植株的獲得[J].中國農業科學,2007,40(9):1849～1855.

[16]Li W,Ruf S,Bock R.Chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker for plastid transformation[J].Plant Molecular Biology,2011,76:443～451.

[17]Day A,Goldschmidt-Clermont M.The chloroplast transformation toolbox:selectable markers and marker removal[J].Plant Biotechnology Journal,2011,9:540～553.

[18]Vafaee Y,Staniek A,Manchenosolano M,etal.A modular cloning toolbox for the generation of chloroplast transformation vectors[J].Plos One,2014,9:1045～1051.

[19]Dufourmantel N,Pelissier B,Garcon F,etal.Generation of fertile transplastomic soybean[J].Plant Molecular Biology,2004,55:479～489.

[20]Díaz A H,Koop H U.Nicotianatabacum:PEG-mediated plastid transformation[J].Chloroplast Biotechnology:Methods and Protocols,2014:165～175.

[21]McCabe M S,Klaas M,Gonzalez-Rabade N,etal.Plastid transformation of high-biomass tobacco variety Maryland Mammoth for production of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) p24 antigen[J].Plant Biotechnology Journal,2008,6:914～929.

[22]Stegemann S,Bock R.Exchange of genetic material between cells in plant tissue grafts[J].Science,2009,324:649～651.

[23]Stegemann S,Keuthe M,Greiner S,etal.Horizontal transfer of chloroplast genomes between plant species[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2012,109:2434～2438.

[24]Fuentes I,Stegemann S,Golczyk H,etal.Horizontal genome transfer as an asexual path to the formation of new species[J].Nature,2014,511:232～235.

[25]Thyssen G,Svab Z,Maliga P.Cell-to-cell movement of plastids in plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2012,109:2439～2443.

[26]Greiner S,Bock R.Tuning a ménage à trois:co-evolution and co-adaptation of nuclear and organellar genomes in plants[J].BioEssays,2013,35:354～365.

[27]Ruhlman T,Verma D,Samson N,etal.The role of heterologous chloroplast sequence elements in transgene integration and expression[J].Plant Physiology,2010,152:2088～2104.

[28]Marchis F D,Pompa A,Bellucci M.Plastid proteostasis and heterologous protein accumulation in transplastomic plants[J].Plant Physiology,2012,160:571～581.

[29]Apel W,Schulze W X,Bock R.Identification of protein stability determinants in chloroplasts[J].The Plant Journal,2010,63:636～650.

[30]Scharff L B,Bock R.Synthetic biology in plastids[J].The Plant Journal,2014,78:783～798.

[31]Bohmert-Tatarev K,Mcavoy S,Daughtry S,etal.High levels of bioplastics are produced in fertile transplastomic tobacco plants engineered with a synthetic operon for production of polyhydroxybutyrate[J].Plant Physiology,2011,155:1690～1708.

[32]Bock R.Strategies for metabolic pathway engineering with multiple transgenes[J].Plant Molecular Biology,2013,83:21～31.

[33]Lu Y,Rijzaani H,Karcher D,etal.Efficient metabolic pathway engineering in transgenic tobacco and tomato plastids with synthetic multigene operons[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2013,110:623～632.

[34]Zhou F,Karcher D,Bock R.Identification of a plastid intercistronic expression element (IEE) facilitating the expression of stable translatable monocistronic mRNAs from operons[J].The Plant Journal,2007,52:961～972.

[35]Caroca R,Howell K A,Hasse C,etal.Design of chimeric expression elements that confer high-level gene activity in chromoplasts[J].The Plant Journal,2013,73:368～379.

[36]L?ssl A,Bohmert K,Harloff H,etal.Inducible trans-activation of plastid transgenes:expression of theR.eutrophaphboperon in transplastomic tobacco[J].Plant and Cell Physiology,2005,46:1462～1471.

[37]Muhlbauer S,Koop H.External control of transgene expression in tobacco plastid using the bacteriallacrepressor[J].Plant Journal for Cell & Molecular Biology,2005,43:941～946.

[38]Verhounig A,Arntzen C J.Inducible gene expression from the plastid genome by a synthetic riboswitch[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2010,107:6204～6209.

[39]Magee A M,Coyne S,Murphy D,etal.T7 RNA polymerase-directed expression of an antibody fragment transgene in plastids causes a semi-lethal pale-green seedling phenotype[J].Transgenic Research,2004,13:325～337.

[40]Ruhlman T A,Rajasekaran K,Cary J W.Expression of chloroperoxidase fromPseudomonaspyrrociniain tobacco plastids for fungal resistance[J].Plant Science,2014,228:98～106.

[41]Chan Y L,He Y,Hsiao T T,etal.Pyramiding taro cystatin and fungal chitinase genes driven by a synthetic promoter enhances resistance in tomato to root-knot nematodeMeloidogyneincognita[J].Plant Science,2015,231:74～81.

[42]Wang X,Su J,Sherman A,etal.Plant-based oral tolerance to hemophilia therapy employs a complex immune regulatory response including LAP+ CD4+ T cells[J].Blood,2015,125:2418～2427.

[43]Sherman A,Su J,Lin S,etal.Suppression of inhibitor formation against FVIII in a murine model of hemophilia A by oral delivery of antigens bioencapsulated in plant cells[J].Blood,2014,124:1659～1668.

[44]Gisby M F,Day A.Growth of transplastomic cells expressing D-amino acid oxidase in chloroplasts is tolerant to D-alanine and inhibited by D-valine[J].Plant Physiology,2012,160:2219～2226.

[45]Chen P J,Senthilkumar R,Jane W N,etal.TransplastomicNicotianabenthamianaplants expressing multiple defence genes encoding protease inhibitors and chitinase display broad-spectrum resistance against insects,pathogens and abiotic stresses[J].Plant Biotechnology Journal,2014,12:503～515.

[46]Khan M S,Kanwal B,Nazir S.Metabolic engineering of the chloroplast genome reveals that the yeastArDHgene confers enhanced tolerance to salinity and drought in plants[J].Frontiers in Plant Science,2015,6:725.doi:10.3389/fpls.2015.00725

[47]Wani S H,Sah S K,Sági L,etal.Transplastomic plants for innovations in agriculture.A review[J].Agronomy for Sustainable Development,2015,35:1391～1430.

[48]Petersen K,Bock R.High-level expression of a suite of thermostable cell wall-degrading enzymes from the chloroplast genome[J].Plant Molecular Biology,2011,76:311～321.

[編輯] 余文斌

2017-04-24

主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心開放基金項目(2015MS006)。

母連勝(1991-)，男，碩士生，研究方向為水稻遺傳與基因工程。通信作者：田志宏，zhtian@yangtzeu.edu.cn。

Q812

A

1673-1409(2017)14-0052-06

[引著格式]母連勝，何勇，田志宏.植物葉綠體遺傳轉化技術及應用研究進展[J].長江大學學報(自科版) ，2017，14(14)：52～57.