嗜線蟲致病桿菌YL001抑菌活性成分及其產量影響因素的研究

許 鵬，李忝珍，張淑靜，劉 啟，王永宏，張 興

(西北農林科技大學 無公害農藥研究服務中心，陜西楊凌 712100)

嗜線蟲致病桿菌YL001抑菌活性成分及其產量影響因素的研究

許 鵬，李忝珍，張淑靜，劉 啟，王永宏，張 興

(西北農林科技大學 無公害農藥研究服務中心，陜西楊凌 712100)

采用硅膠柱層析等分離方法，結合MS與NMR技術，對嗜線蟲致病桿菌YL001發酵產物中的抑菌活性成分進行分離鑒定；采用微量稀釋法對Nematophin的抑菌活性進行測定；利用HLPC分析不同因素對Nematophin產生的影響。結果表明，分離得到主要抑菌活性物質 Nematophin，并鑒定其結構為3-吲哚乙基(3′-甲基-2′-酮)戊酰胺，其對革蘭氏陽性菌具有較好的抑菌活性；不同菌株發酵產物中Nematophin的產量不同，其中YL001菌株的產量最高，為115.23 μg/mL；Nematophin產量在初始pH 4.5～8.5逐漸升高，初始pH 8.5時最高，為155.08 μg/mL。發酵罐培養條件下Nematophin的產量高于搖瓶，且在初始pH 8.5時達到最高，為206.97 μg/mL。主要抑菌活性物質與文獻報道的 Nematophin相同，昆蟲病原線蟲共生菌次生代謝物的產生與菌種、菌株及培養條件密切相關。

嗜線蟲致病桿菌；分離；抑菌活性；Nematophin

昆蟲病原線蟲共生細菌是寄生于昆蟲病原線蟲腸道內的一種革蘭氏陰性細菌，包括致病桿菌(Xenorhabdus)和發光桿菌(Photorhabdus)屬，分別與斯氏線蟲(Steinernema)和異小桿線蟲(Heterorhabditis)共生，屬腸桿菌科(Enteobacteriaceae)[1]，存在于侵染期線蟲腸道內，在昆蟲血腔內繁殖，產生毒素并分解昆蟲的營養物質，使其患敗血癥死亡[2-3]。共生菌能產生多種次生代謝產物，這些代謝產物不僅具有多種化學結構，而且在醫藥和農業上具有廣泛的生物活性[4]。目前已從致病桿菌(Xenorhabdus)和發光桿菌(Photorhabdus)中分離鑒定出40多種具有生物活性的代謝產物，這些代謝產物化學結構多樣，在醫藥和農業上有廣泛的生物活性，如抗細菌和真菌、殺蟲、殺線蟲、抗潰瘍、抗腫瘤和抗病毒[4-6]作用。線蟲共生菌次生代謝物的產生與菌種、菌株及培養條件密切相關。不同種致病桿菌產生的抑菌物質有較大差異；同一菌株在不同培養條件下的代謝也有一定差異[5-10]。培養基供給共生菌生長、繁殖、代謝和合成抑菌物質所需要的營養物質，它的成分和組分含量對共生菌的生長及抑菌物質的產生等均有較大影響；不同共生菌對營養物質的要求各不相同，同一菌種在不同生長階段對營養的需求也有一定差異。另外，發酵條件也是影響發酵過程中各種化學及生物學反應的環境因素，主要包括pH、發酵時間、種齡、接種量、通氣和溫度等[11]。發酵條件不同產生的代謝產物同樣存在差異。

嗜線蟲致病桿菌YL001(XenorhabdusnematophilaYL001)是西北農林科技大學無公害農藥研究中心分離得到的一株對植物病原菌有較強抑制作用的昆蟲病原線蟲共生菌[12]，前期研究[13]發現YL001菌株發酵上清液乙酸乙酯粗提物對多種病原菌具有較好的抑制效果，隨著初始pH的升高，其發酵液和乙酸乙酯提取物的抑菌活性也逐步提高，初始pH可以顯著影響X.nematophilaYL001的抑菌活性及代謝，堿性條件更有利于活性物質的產生[14]。因此，為明確不同酸堿條件下YL001菌株抑菌物質產生的差異，本文對該菌株的發酵液乙酸乙酯粗提物中主要抑菌活性物質進行分離，通過波譜分析鑒定其化學結構，并進行不同菌株和不同培養條件下Nematophin的HPLC定量分析，研究結果為該菌的產業化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養基

1.1.1 供試菌株 嗜線蟲致病桿菌XenorhabdusnematophilaYL001(簡稱YL001)由西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心提供；嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdusnematophila) AN6、ALL、A24(簡稱AN6、ALL、A24)和伯氏致病桿菌(Xenorhabdusbovienii) X-7(簡稱X-7)由廣東省昆蟲研究所提供。

1.1.2 供試病原菌 大腸桿菌(Escherichiacoli)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白菜軟腐病菌(Erwiniacarotorora)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)、獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.actinidae)均由西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心提供。

1.1.3 培養基 鑒別培養基[15]NBTA：牛肉膏3 g/L，蛋白胨5 g/L，營養瓊脂 15 g/L，溴麝香百里酚蘭 0.025 g/L，氯化三苯基四氮唑 0.04 g/L，pH7.0。

種子培養基LB：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

發酵培養基TSB：胰蛋白胨17 g/L，大豆胨3 g/L，NaCl 5 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，pH 7.0。

病原細菌培養基(NA培養基)：牛肉膏3 g/L，蛋白胨5 g/L，營養瓊脂15 g/L，pH 7.0。

各處理發酵培養基初始pH分別用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl調節，其余培養基pH 7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵培養 種子制備：挑取種管保存的共生菌單菌落于LB培養基，在28 ℃、180 r/min活化24 h后劃線于NBTA平板，25 ℃培養48 h，觀察菌落的顏色變化，區分初生型和次生型共生菌。菌落為藍色，周圍培養基中的染料被吸收變為黃色的為初生型；菌落為紅色，周圍培養基中染料不被吸收而保持藍色的為次生型。用接種環挑取初生型菌，接種于LB培養基，28 ℃、180 r/min振蕩培養至OD600 nm為2.00，作為種子。

搖瓶發酵：按9%的接種量將種子接于裝有100 mL發酵培養基的500 mL搖瓶中，在搖床轉速180 r/min、28 ℃條件下培養。

發酵罐發酵：使用鎮江東方生物工程設備技術公司生產的GUJS-7B型5 L全自動控制發酵罐進行發酵。發酵罐容積5 L，2層6平直葉攪拌器，3擋板。裝料系數0.75，接種量9%，發酵溫度28 ℃，通氣量2.5 L/min，攪拌轉速200 r/min，發酵過程中流加泡敵消泡。

1.2.2 乙酸乙酯粗提物的制備 取低溫保存共生菌發酵液，調pH除去蛋白后9 000 r/min、4 ℃離心30 min，發酵上清液用乙酸乙酯萃取4次，萃取液通過無水硫酸鈉柱后濃縮蒸干，備用，干物質量濃度為625 mg/L。

1.2.3 柱層析分離 采用柱層析分離方法對乙酸乙酯粗提物進行分離，以枯草芽孢桿菌(B.subtilis)作為指示菌，利用瓊脂擴散法[12-13]進行抑菌活性追蹤。

1.2.4 波譜測定 質譜(MS)用電子轟擊質譜(EI-MS)測定，核磁結構測定用Bruker-ADVANCE III500核磁共振儀，紅外光譜(IR)用Shimadzu IR-外光譜儀測定，高效液相色譜儀(996，Waters公司)Thermo 反向C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)；流動相為[V(乙腈)∶V(水)]= 65∶35(水中含φ=0.1%甲酸)；流速1.0 mL/min；檢測波長為254 nm。

1.2.5 抑菌活性物質的生物活性測定 采用瓊脂稀釋法[16]測定分離所得化合物Nematophin對細菌的最小抑制質量濃度(MIC)。

1.2.6 Nematophin HPLC定量分析 各處理干樣分別溶于1 mL甲醇至4 ℃冰箱，備用。每個處理3次重復。HPLC定量分析采用外標法，液相色譜儀(600，Waters公司)Thermo 反向C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)；流動相：0～2 min為10%乙腈，2～20 min為10%～40%乙腈，20～40 min為40%～100%乙腈，40～45 min為100%～10%乙腈，45～55 min為10%乙腈；流速1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；進樣量10 μL；柱溫30 ℃。

以不同質量濃度標準品Nematophin建立標準曲線來測定各樣品中Nematophin的產量。

1.2.7 數據分析 作圖采用Excel 2007及Empower軟件，方差分析采用SPSS 22.0。

2 結果與分析

2.1 抑菌活性物質的提取、分離和純化

將乙酸乙酯粗提物硅膠柱層析，分別用石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷進行洗脫，得到3個組分，采用活性追蹤法，對有活性的三氯甲烷洗脫組分進行進一步柱層析分離，得到抑菌活性物質純品；液相檢測其純度為99.6%，如圖1所示。

2.2 結構鑒定及理化性質

Electron impact MS質譜顯示，相對分子質量為272.04，結合NMR信息(表1)及紅外光譜結果確定分子式為C16H20N2O2，與已報道主要抑菌化合物Nematophin[16]結構一致。結構如圖2所示，Nematophin為白色晶體，易溶于乙酸乙酯、氯仿、丙酮和甲醇，微溶解于石油醚，不溶于水。在中性和堿性條件下穩定。

圖1 Nematophin液相圖Fig.1 HPLC result of Nematophin

位置編號Positionno氫譜1H-NMR碳譜13C-NMRNH8.03(lH,bs)1-NH7.11(1H,bd,J=3.0Hz)27.07(1H,bd,J=3.0Hz)112.33112.647.66(1H,dd,J=9.8Hz,0.75Hz)118.757.27(1H,td,J=10.1Hz,1.5Hz)122.067.18(1H,td,J=9.9Hz,1.3Hz)119.677.44(1H,d,J=10.0Hz)111.38127.29136.5103.07(2H,t,J=5.1Hz)25.5113.70(2H,q,J=5.0Hz)39.61’202.42’160.13’3.55(1H,sext,J=4.9Hz)40.44’1.79(1H,m)25.21.46(1H,m)5’11.53’-CH315.2

2.3 Nematophin的抑菌活性測定

由表2可知，Nematophin對革蘭氏陽性細菌具有較高的抑菌活性，對革蘭氏陰性菌活性較差；其中對金黃色葡萄球菌具有較好的抑制作用，其MIC為2.5 μg/mL；對獼猴桃潰瘍病菌及大腸桿菌表現出較低的抑制活性。

圖2 Nematophin結構式Fig.2 Sructure of Nematophin

供試病原細菌Pathogenicbacterium最小抑制質量濃度/(μg/mL)MIC枯草芽孢桿菌 Bacillussubtilis12.5蠟狀芽孢桿菌 Bacilluscereus12.5金黃色葡萄球菌 Staphylococcusaureus2.5白菜軟腐病菌 Erwiniacarotorora25水稻白葉枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae25獼猴桃潰瘍病菌Pseudomonassyringaepv.actinidae>100大腸桿菌 Escherichiacoli>100

2.4 致病桿菌不同菌種及菌株中Nematophin 的HPLC定量分析

由表3可知，不同菌種及菌株間Nematophin的產量存在較大差異，其中伯氏致病桿菌X.bovieniiX-7不產生Nematophin；在X.nernatophila的各菌株中，Nematophin 的產量隨發酵時間的延長逐漸升高。其中，YL001菌株中Nematophin的產量最高，A24菌株中Nematophin的產量最低。

表3 致病桿菌不同菌種及菌株中Nematophin 的產量Table 3 Nematophin in different species and strains of Xenorhabdus μg/mL

注：數據均為3次重復平均值，采用Duncan’s，同列數據后不同大小寫字母表示差異顯著(P<0.01)，同行數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Note: Data is the average of 3 duplications, and different capital and small letters followed after data in each column mean significant difference atP<0.01 andP<0.05,respectively.The same as below.

2.5 不同初始pH條件下YL001菌株發酵產物中Nematophin 的HPLC定量分析

2.5.1 搖瓶發酵培養 由圖3可知，Nematophin產量隨初始pH的升高(4.5～8.5)呈升高趨勢，pH為8.5時達到最高，為155.08 μg/mL ；pH為9.5時Nematophin的產量突然降低，說明中性及偏堿性條件下更有利于Nematophin的產生。

2.5.2 發酵罐發酵培養 由表4可知，Nematophin產量隨初始pH的升高(5.5～8.5)呈升高趨勢，在同一pH條件下，Nematophin產量隨時間呈升高趨勢，在初始pH為8.5時達到最高(206.97 μg/mL)，與搖瓶發酵時不同初始pH條件下YL001菌株中Nematophin產量變化的結果相似，但明顯高于搖瓶發酵初始pH為8.5時的產量(155.08 μg/mL)。

圖3 不同初始pH條件下Xenorhabdus nematophila YL001中Nematophin的產量Fig.3 Nematophin of Xenorhabdus nematophila YL001 in different initial pH

表4 不同初始pH條件下XenorhabdusnematophilaYL001中Nematophin 的產量
Table 4 Nematophin ofXenorhabdusnematophilaYL001 in different initial pH μg/mL

3 結論與討論

本研究鑒定的X.nematophilaYL001菌株代謝產物主要抑菌活性物質的結構與Nematophin[16]一致，對其進行生物活性測定發現，Nematophin對革蘭氏陽性及革蘭氏陰性菌都有一定的抑制作用，尤其對革蘭氏陽性菌表現出較好的活性，對枯草芽孢桿菌的MIC(12.5 μg/mL)與文獻[16]中Nematophin對枯草芽孢桿菌的MIC(12 μg/mL)結果接近；對金黃色葡萄球菌MIC為2.5 μg/mL比文獻[16]中Nematophin對金黃色葡萄球菌MIC為1.5 μg/mL高。Seunguk等[17]測定Nematophin對金黃色葡萄球菌MIC為0.391 μg/mL，可能由于不同菌株的金黃色葡萄球菌對Nematophin敏感性不同；該化合物對植物病原真菌灰霉病菌及疫霉病菌也表現出較好的抑制MIC(12 μg/mL)[16]，Nematophin具有較好的開發前景，它對植物病原真菌的抑制作用還需進一步研究。此外，國內曾報道[18]該化合物還有較好的抗腫瘤活性。

共生菌次生代謝物的產生與菌種、菌株及培養條件密切相關。不同種的致病桿菌產生的抑菌物質有較大的差異，本研究中發現，Nematophin的產量隨菌株的不同而表現明顯差異，嗜線蟲致病桿菌YL001菌株在相同培養條件下Nematophin產量最高，而伯氏致病桿菌X-7的代謝產物中沒有檢測到Nematophin，但是前期研究中發現致病桿菌X-7代謝產物乙酸乙酯提取物也表現出較好的抑菌活性，可能是有其他的抑菌化合物存在；說明同屬不同種或同種不同菌株，在相同培養條件下產生的抗菌物質有很大差別。

同一菌株在不同培養條件下的代謝也有一定差異。初始pH作為細菌生長的重要影響因子，對共生菌細胞生長、產物積累以及生物活性同樣具有重要的影響[19]。本研究發現，不同初始pH培養條件下，在一定范圍內Nematophin的產量隨pH的升高而升高，初始pH 8.5時，Nematophin產量達到最高，這與郭樹奇[14]通過LC-MS分析YL001菌株在不同pH條件下Nematophin產量的結果(pH 8.5時Nematophin的產量為pH 4.5時的17.52倍)一致；發酵罐培養條件下Nematophin產量明顯高于搖瓶發酵。

嗜線蟲致病桿菌次生代謝物Nematophin的產生與菌種、菌株及培養條件密切相關。不同種致病桿菌產生的抑菌物質有較大差異，同一菌株在不同培養條件下的代謝也有一定差異，為今后工業化開發具有指導意義。

Reference：

[1] GAUGLER R.Entomopathogenic Nematology [M].New York: CABI Publishing,2002.

[2] MARTENS E C,HEYNGENS K,GOODRICH B H.Early colonization events in the mutualistic association betweenSteinernemacarpocapsae nematodes andXenorhabdusnematophilabacteria [J].JournalofBacteriology,2003,185(10):3147-3154.

[3] WATERFIELD N R,BOWEN D J,FETHERSON J D,etal.The toxin complex genes ofPhotorhabdus: a growing gene family [J].TrendsinMicrobiology,2001,9(4):185-191.

[4] CHEN G,MAXWELL P,DUNPHY G B,etal.Culture conditions ofXenorhabdusandPhotorhabdussymbionts of Entomopathogenic nematodes[J] .Nematologica,1996,42(1):124-130.

[5] QIU X,HAN R,YAN X ,etal.Identification and characterization of a novel gene involved in the trans-Specific nematicidal activity ofPhotorhabdusluminescensLN2 [J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2009,75(12):4221-4223.

[6] BERNIE V,MCLNERNEY W C,TAYLOR M J,etal.Biologically active metabolites fromXenorhabdusspp.,part 2.Benzopyran-1-one derivatives with gastroprotective activity [J].JournalofNaturalProducts,1991,54(3):785-795.

[7] LANG G,KALVELAGE T,PETERS A,etal.Linear and cyclic peptides from the Entomopathogenic bacteriumXenorhabdusnematophilus[J].JournalofNaturalProducts,2008,71(6):1074-1077.

[8] GUALTIERI M,AUMELAS A,THALER J O.Identification of a new antimicrobial lysine-rich cyclolipopeptide family fromXenorhabdusnematophila.[J].TheJournalofAntibiotics,2009,62(6):295-302.

[9] FUCHS S W,PROSCHAK A,JASKOALL T W,etal.Structure elucidation and biosynthesis of lysine-rich cyclic peptides inXenorhabdusnematophila[J].Organic&BiomolecularChemistry,2011,9(9):3130-3132.

[10] 楊秀芬,楊懷文,簡 恒,等.嗜線蟲致病桿菌產生抗生素的培養基及條件 [J].微生物學通報,2001,28(1):12-16.

YANG X F,YANG H W,JIAN H,etal.Effect of fermentation conditions on antibiotic production ofXenorhabdusnematophila[J].MicrobiologyChina,2001,28 (1):12-16(in Chinese with English abstract).

[11] FANG X L,HAN L R,CAO X Q,etal.Statistical optimization of process variables for antibiotic activity ofXenorhabdusbovienii[J].PLosOne,2012,7(6):e38421.

[12] 王永宏,張 興.2株昆蟲病原線蟲共生菌代謝物的抑菌作用[J].西北農林科技大學學報(自然科學版),2007,35(2):125-130.

WANG Y H,ZHANG X.Studies on antimicrobial activity of metabolites of symbiotic bacteria associated with Entomopathogenic nematodes [J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition),2007,35(2):125-130(in Chinese with English abstract).

[13] 許 賢,王永宏,劉 霞,等.昆蟲病原線蟲共生菌篩選及其發酵液抑菌活性初步研究[J].西北農林科技大學學報(自然科學版),2006,34(7):50-54.

XU X,WANG Y H,LIU X,etal.Entomopathogenic nematodes symbiotic bacteria screening and preliminary study of the fermented liquid antibacterial activity[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition),2006,34(7):50-54(in Chinese with English abstract).

[14] 郭樹奇.pH調控嗜線蟲致病桿菌抑菌活性機理的初步研究[D].陜西楊凌:西北農林科技大學,2015.

GUO SH Q.Study on antibacterial mechanism ofXenorhabdusnematophilaregulated by pH [D].Yangling Shaanxi: Northwest A&F University,2015(in Chinese with English abstract).

[15] AKHURST R J.Morphological and functional dimorphism inXenorhabdusspp.,bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodesNeoaplectanaandHeterorhabditis[J].Microbiology,1980,121(2):303-309.

[16] LI J,CHEN G,WEBSTER J M.Nematophin,a novel antimicrobial substance produced byXenorhabdusnematophila(Enterobacteriaceae) [J].CanadianJournalofMicrobiology,1997,43(8):770-773.

[17] SEUNGUK P,MYUNG K P,SEONG H J,etal.Isolation and synthesis of tryptamine derivatives from a symbiotic bacteriumXenorhabdusnematophilusPC [J].BulletinoftheKoreanChemicalSociety,2003,24(5):623-626.

[18] 呂秋軍,簡 恒,劉衛京,等.從嗜線蟲桿菌分離的吲哚衍生物抗腫瘤活性的研究[J].中國新藥雜志,2002,11(11):850-852.

Lü Q J,JIAN H,LIU W J,etal.Study on the anti-tumor activity of an indole derivative isolated fromXenorhabdus[J].ChineseJournalofNewDrug,2002,11(11): 850-852(in Chinese with English abstract).

[19] WANG Y H,FANG X L,CHENG Y P,etal.Manipulation of pH shift to enhance the growth and antibiotic activity ofXenorhabdusnematophila[J].JournalofBiomedicineandBiotechnology,2011(1):137-143.

(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Antimicrobial Active Constituents and Its Yield Influencing Factors ofXenorhabdusnematophilusYL001

XU Peng, LI Tianzhen, ZHANG Shujing, LIU Qi, WANG Yonghong and ZHANG Xing

(Research and Development Center of Biorational Pesticides, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

The active ingredients from fermentation broth ofXenorhabdusnematophilusYL001 were isolated and purified by column chromatography and other extraction process, and their structures were identified by MS and NMR spectra.The minimal inhibitory concentrations (MIC) against bacteria of the purified Nematophin were detected by broth dilution technique.Analyzing the yield influencing factors of Nematophin by using HPLC.The factors related to Nematophin production, including different strains of the same species and culture conditions, were also explored.The results showed that one antibacterial ingredient was isolated from fermentation broth ofXenorhabdusnematophilusYL001 and identified as Nematophin with a chemical name of 3-indoleethyl (3′-methyl-2′-oxo)pentanamide which possesses significant activity against Gram-positive bacteria.The output of Nematophin was different fromXenorhabdusneamatophilastrains, and the highest yield of Nematophin was obtained from YL001 strain, which was 115.23 μg/mL.The yield of Nematophin increased in the range of initial pH 4.5 to pH 8.5, and the highest yield, 155.08 μg/mL, was obtained at pH 8.5.The yield of Nematophin was higher in fermentation tank than in the Erlenmeyer flask, and the highest yield,206.97 μg/mL, of Nematophin was obtained in fermentation tank at pH 8.5.In conclusion, the main ingredient inXenorhabdusneamatophilawas designated as Nematophin identified by former documents, the secondary metabolites of the insect pathogenic nematode symbiotic bacteria is closely related to the bacteria, strain, and the cultured conditions.

Xenorhabdusneamatophila；Isolation；Antibacterial activity；Nematophin

XU Peng, male, master student .Research area: pesticide toxicology and microbial metabolism.E-mail:xupeng19900721@126.com

WANG Yonghong, male,research fellow, doctoral supervisor.Research area: microbial pharmaceutical and fermentation technology.E-mail:yhwang@nwsuaf.edu.cn

日期：2016-12-29

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1009.044.html

2015-12-17

2016-01-15

國家自然科學基金(31171910)；陜西省自然科學基金重點項目(2014JZ004)；中央高?；究蒲袆撔轮攸c項目(ZD2013003)。

許 鵬，男，碩士研究生，研究方向為農藥毒理學和微生物代謝。E-mail: xupeng19900721@126.com

王永宏，男，研究員，博士生導師，研究方向為微生物制藥及發酵技術。E-mail: yhwang@nwsuaf.edu.cn

S482.2+92

A

1004-1389(2017)02-0317-06

Received 2015-12-17 Returned 2016-01-15

Foundation item The National Natural Science Foundation of China (No.31171910); Key Project of Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2014JZ004); Central University Basic Research and Innovation Projects (No.ZD2013003).