有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)慢性腦缺血小鼠的PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

張鐘元+陳嘉勤+陳偉+毛海峰+周柏存+屈紅林+李娣+彭琪

摘 要：目的：探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)慢性腦缺血小鼠干預(yù)效果及PI3K/Akt信號(hào)通路的影響。方法：參考Yoshizaki建立的小鼠慢性腦缺血模型，選擇KM小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，構(gòu)建小鼠慢性腦缺血模型；應(yīng)用神經(jīng)行為學(xué)分析、尼氏染色、免疫組化實(shí)驗(yàn)技術(shù)，比較有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)該模型的干預(yù)效果，探討其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制；建模成功后，將小鼠隨機(jī)四組：SO組、M組、SW組、TM組。SW組：術(shù)后3～4天適應(yīng)性游泳30分鐘，繼后每天遞增10分鐘，逐漸延長(zhǎng)至60分鐘，持續(xù)6周，每周休息1天。TM組：術(shù)后第1周進(jìn)行3次適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，每次60分鐘，每周6次，持續(xù)6周。結(jié)論：兩種有氧運(yùn)動(dòng)均能對(duì)本模型的腦細(xì)胞發(fā)揮抗損傷作用，且其干預(yù)效果TM組優(yōu)于SW組；兩種有氧運(yùn)動(dòng)可能均通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K /Akt信號(hào)通路的表達(dá)，達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抗腦組織傷害的作用。

關(guān)鍵詞：有氧運(yùn)動(dòng)；慢性腦缺血；PI3K；Akt；信號(hào)通路

慢性腦缺血是指各種原因引發(fā)的長(zhǎng)期腦血流灌注不足，為臨床上常見(jiàn)的腦損傷之一，可導(dǎo)致持久或進(jìn)展性的認(rèn)知與神經(jīng)功能障礙[1]。

細(xì)胞凋亡又稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞在某些生理或病理?xiàng)l件下發(fā)生的有序的主動(dòng)性非炎癥性死亡。研究認(rèn)為，腦缺血后與細(xì)胞凋亡有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有有絲分裂原蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K） /絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號(hào)通路[2]。Akt又名蛋白激酶B（PKB），為分子量大約為60 kD的蛋白激酶。Akt能使絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）磷酸化，故又稱(chēng)為絲氨酸/蘇氨酸激酶。Akt能介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子。因子PI32K激活的Akt可以介導(dǎo)胰島素、多種生長(zhǎng)因子、凝血酶等誘發(fā)的細(xì)胞生長(zhǎng)，能經(jīng)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞存活[3]。

本研究采用結(jié)扎右頸動(dòng)脈的方法構(gòu)建了小鼠酒精性肝損傷模型，采用跑臺(tái)和游泳兩種不同的有氧運(yùn)動(dòng)方式干預(yù)，通過(guò)神經(jīng)行為學(xué)、顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)觀察以上干預(yù)對(duì)腦缺血損傷小鼠的影響；采用免疫組化實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路上下游相關(guān)因子的差異表達(dá)，探討其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1.研究方法

（1）動(dòng)物模型的構(gòu)建：成年健康雄性KM小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠（0.3ml/100g體重），參考Yoshizaki的方法結(jié)扎小鼠右頸動(dòng)脈構(gòu)建慢性腦缺血損傷小鼠動(dòng)物模型。

（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組以及運(yùn)動(dòng)方案：建模成功后，將小鼠隨機(jī)分為四組：假手術(shù)組（SO）、模型對(duì)照組（M）、游泳組（SW）、跑臺(tái)組（TM），每組10只，建模后3—4天對(duì)其進(jìn)行干預(yù)。

（3）組織形態(tài)學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取小鼠腦組織進(jìn)行石蠟包埋，尼氏染色，解剖形態(tài)學(xué)觀察。

（4）神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估：Clark神經(jīng)功能評(píng)分方法，根據(jù)癥狀表現(xiàn)程度分0、1、2、3、4遞增等級(jí)，對(duì)小鼠步態(tài)、攀爬能力、轉(zhuǎn)圈、胡須反應(yīng)、眼睛、耳朵、毛發(fā)等的情況進(jìn)行綜合評(píng)分。

（5）免疫組織化學(xué)分析：檢測(cè)缺血腦組織中的PI3K、Akt、mTOR的表達(dá)，采用SABC法的免疫組織化學(xué)法進(jìn)行以上因子的定位和半定量表達(dá)檢測(cè)。在10×20倍光學(xué)顯微鏡下，觀察并計(jì)算PI3K、AKT、mTOR的陽(yáng)性表達(dá)面積百分比[4]（陽(yáng)性反應(yīng)面積/測(cè)量面積）。

2.結(jié)果與分析

（1）小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估：分別記錄建模后無(wú)干預(yù)和建模后進(jìn)行有氧干預(yù)的得分（三次評(píng)分取平均值）。

（2）解剖形態(tài)學(xué)觀察：組小鼠尼氏體排列緊密，大且數(shù)量較多，神經(jīng)元受損程度小；M組排列疏、欠規(guī)整，且數(shù)量較少；與M組相比，SW、TM組中尼氏體數(shù)量較多，排列緊密，僅次于SO組，TM排列有規(guī)則較集中，效果優(yōu)于SW組。

（3）免疫組織化學(xué)分析。圖2顯示：小鼠腦細(xì)胞PI3K、Akt主要表達(dá)于細(xì)胞漿。PI3K表達(dá)強(qiáng)弱依次為SO>TM>SW>M組；Akt表達(dá)強(qiáng)到弱依次為SO>TM>SW>M組。

表2可見(jiàn)：小鼠腦組織中PI3K、Akt免疫組化中SO組陽(yáng)性表達(dá)最高，SW組、TM組表達(dá)均高于M組（P<0.01），且TM組表達(dá)更顯著；與M組的Akt表達(dá)相比，SO組的Akt表達(dá)具有非常顯著的差異（P<0.01）。

3.討論

（1）小鼠腦缺血模型。腦缺血理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)研究取得進(jìn)展的關(guān)鍵性因素之一。由于本實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的有氧游泳和跑臺(tái)的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，我們對(duì)所選小鼠的右頸動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎以構(gòu)模。術(shù)后我們跟蹤觀察小鼠的情況，發(fā)現(xiàn)小鼠右眼半閉或全閉。這說(shuō)明小鼠建模成功，且其成功率達(dá)90%，應(yīng)用此模型可以順利完成本研究。

（2）有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠腦缺血干預(yù)的效果。近年來(lái)，大量有關(guān)有氧運(yùn)動(dòng)康復(fù)訓(xùn)練治療急性缺血性腦血管疾病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得了一定的成果。適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠促使腦血管新生，增強(qiáng)抗氧化能力，減輕腦細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)等。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，對(duì)小鼠建模前、后以及有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后神經(jīng)功能的評(píng)分，除M組外，各干預(yù)組都有明顯的變化。腦組織尼氏染色顯示，相比于M組，有氧運(yùn)動(dòng)組尼氏小體相對(duì)清楚有規(guī)律，TM組尤為顯著，這說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠腦部神經(jīng)元細(xì)胞的再生以及保護(hù)有著重要的作用，其能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖以及分化，促進(jìn)軸突及樹(shù)突的生長(zhǎng)。

（3）有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)與PI3K/Akt信號(hào)通路表達(dá)影響。腦缺血后與細(xì)胞凋亡有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有有絲分裂原蛋白激酶（ MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K） /絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號(hào)通路。PI3K是一種可使肌醇環(huán)第三位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶。PI3K被激活后生成的磷脂產(chǎn)物進(jìn)一步激活A(yù)kt及其下游的信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)， 參與生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和細(xì)胞的存活。PI3K激活的Akt可以介導(dǎo)胰島素、多種生長(zhǎng)因子、凝血酶等誘發(fā)的細(xì)胞生長(zhǎng)，能經(jīng)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞存活。從小鼠腦組織免疫組織化學(xué)結(jié)果的分析可見(jiàn)，PI3K/Akt的表達(dá)情況在游泳組和跑臺(tái)組的表達(dá)面積遠(yuǎn)高于模型對(duì)照組、低于假手術(shù)組，且跑臺(tái)組表達(dá)面積更佳。由此可知，有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)該模型中的鼠腦組織發(fā)揮著保護(hù)作用，能抑制細(xì)胞的凋亡過(guò)程。其抗損傷作用機(jī)理可能通過(guò)激活PI32K /Akt信號(hào)通路的表達(dá)，達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦組織保護(hù)的作用。

4.結(jié)論

（1）兩種有氧運(yùn)動(dòng)均能對(duì)本慢性腦缺血小鼠模型的腦細(xì)胞發(fā)揮抗損傷作用，且其效果跑臺(tái)組優(yōu)于游泳組。

（2）兩種有氧運(yùn)動(dòng)可能均通過(guò)調(diào)節(jié)PI32K /Akt信號(hào)通路的表達(dá)，達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腦組織傷害作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊運(yùn)華.運(yùn)動(dòng)對(duì)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下胰島素PI3K/Akt/GSK-3信號(hào)傳導(dǎo)通路影響的研究進(jìn)展[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013（21）：142-145.

[2]黃秀蘭，崔國(guó)輝，周克元.PI3K/Akt信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究進(jìn)展[J].癌癥，2008，27（3）：331-336.

[3]朱裕華，袁紅花，吳連連，等.IGF-1通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2014，52（3）： 11-15.

[4]郭 琳，王 強(qiáng).PI3K/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路與惡性腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009， 17（8）：1585-1589.

（作者單位：湖南師范大學(xué)體適能與運(yùn)動(dòng)康復(fù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）