蕨菜組織培養技術研究現狀及發展趨勢

韓喜國，任英，聶振波，高靜，王慶軍，王曉慧

（1.吉林省農業科學院洮南試驗站，137100；2.吉林省農業科學院農業資源與環境研究所；3.吉林大安市樂勝鄉農業技術推廣站；4.吉林梨樹縣郭家店鎮農業技術推廣站）

蕨菜組織培養技術研究現狀及發展趨勢

韓喜國1，任英2，聶振波3，高靜4，王慶軍4，王曉慧2

（1.吉林省農業科學院洮南試驗站，137100；2.吉林省農業科學院農業資源與環境研究所；3.吉林大安市樂勝鄉農業技術推廣站；4.吉林梨樹縣郭家店鎮農業技術推廣站）

從目前蕨菜組織培養技術現狀出發，闡述了外植體、培養基成分、消毒方式及外源添加物對培養效果的影響，并對蕨類組織培養存在的問題、發展趨勢及前景進行分析和討論。

蕨菜；組織培養；影響因素；發展趨勢

蕨菜是醫食兩用的林下野生蔬菜，具有極高的經濟價值和保健功能。基于需求量和持續性發展的要求，其繁殖方式越來越受到研究者及生產者的關注。目前，蕨菜人工馴化繁殖方式主要有3種：根莖繁殖、孢子繁殖和組織培養繁殖。根莖繁殖雖然簡單易操作，成株率和成活率較高，但費工費時且對野生資源破壞嚴重；孢子繁殖雖應用廣泛，但從孢子萌發到孢子體形成和生長，期間所需環境條件極其嚴苛，而孢子萌發所需溫、濕度與真菌孢子萌發的條件相似，導致孢子繁殖成苗率低；組織培養是近年來備受重視的一種快速繁殖方法，它具有取材少、成苗量大、不受季節限制、速度快等優點。

目前，蕨菜組織培養所用外植體材料可分為配子體和孢子體2類，配子體包括孢子和原葉體；孢子體包含根狀莖、葉柄、幼葉等。從適宜的外植體、培養基種類、成分、激素的種類及用量、有機物的添加及培養條件等方面對蕨類組織培養進行了研究。

1 蕨菜組織培養技術

蔗糖、0.5%瓊脂，pH值5.8～6.0，根據需要加入植物生長調節劑。然后將培養基在120℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min備用。

將采集到的成熟孢子用無菌濾紙包好，曲別針固定封口，將紙包置于70%的酒精溶液中消毒30 s，無菌蒸餾水清洗2次，再用0.1%HgCl2消毒150 s，無菌水清洗4～5次。然后用滴管吸取孢子溶液，滴于準備好的培養基中。培養室溫度控制在25℃左右，光強2 500～3 000 lx，每天保證16 h光照。

郭宇蘭等[1]認為，在孢子組織培養的過程中，孢子萌發與無機鹽濃度有關，過高過低都不利于孢子萌發及原葉體形成，適宜的培養基為MS和1/2 MS；最適宜的增殖培養基為：1/2 MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L；最適宜的生根培養基為1/2 MS＋NAA 0.05 mg/L＋IBA 0.2 mg/L。生根率達98.6%。

1.2 以原葉體為外植體的組培技術

1/2 MS為基本培養基，pH值5.8，在壓力1.0～ 1.2 kg/cm2，經20～25 min高壓滅菌待用。

取成形的原葉體，用清水漂洗干凈，0.1%HgCl2消毒5～8 min，再用酒精消毒30 s，最后用無菌水沖洗3～5次，接種到準備好的培養基上。培養溫度20～ 28℃，光照時間3～10 h，光照強度1 500～2 000 lx，培養時間1～2個月。最適宜的原葉體增殖培養基為：1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L；草炭＋松針土是適合原葉體生根的最佳基質[2]。

1.1 以孢子為外植體的組培技術

一般以MS和1/2 MS為基本培養基，附加2%

1.3 以葉柄為外植體的組培技術

1/2 MS為基本培養基，添加蔗糖30 g/L，瓊脂8 g/L，高溫高壓滅菌后備用。取幼嫩蕨菜葉柄沖洗凈浮土，再用洗潔精溶液浸泡10 min，之后用軟毛刷多次刷洗，用自來水沖洗至無泡沫，再用75%酒精消毒20 s，后用0.1%HgCl2消毒5 min，最后用無菌水沖洗4～5次，無菌濾紙吸干表面水分后接種到準備好的培養基上。培養溫度為25℃，光照強度2 000 lx，光照時間為每天13 h。方利娟等[3]、姜長陽等[4]研究證明，蕨菜葉柄誘導愈傷組織的最佳培養基是1/2 MS+0.2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA；愈傷組織增殖最佳培養基是1/2 MS+0.2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA，增殖倍數為8.07；不定苗的生根誘導最佳培養基為1/2 MS＋0.4 mg/L IBA[3]。

1.4 以根狀莖為外植體的組培技術

采集根狀莖幼嫩先端0.5～1.0 cm，先用75%酒精浸30 s，無菌水沖洗3次，轉入1.0%HgCl2中消毒5 min，再用無菌水沖冼3～5次，無菌紙吸干表面水分。基本培養基為1/2 MS培養基附加1.0～1.5 g/L活性炭[5]。

適合誘導分化的培養基為1/2 MS＋1.5 g/L活性炭＋KT 2.0 mg/L＋6-BA 3.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L。

適合繼代培養的培養基為1/2 MS＋1.5 g/L活性炭＋KT 2.0 mg/L＋NAA 0.2～0.5 mg/L。

適合壯苗培養的培養基為1/2 MS＋1.5 g/L活性炭＋6-BA 0.5～1.0 mg/L＋NAA 0.1～1.0 mg/L＋GA30.2～0.5 mg/L＋水解乳蛋白0.1%。

適合生根誘導的培養基為1/2 MS＋1.5 g/L活性炭＋NAA 0.5 mg/L[6]。

目前，在以上幾種蕨菜組織培養中，以孢子和根狀莖為外植體的組培技術應用比較廣泛，且容易成功獲得組培苗。

2 影響蕨菜組織培養效果的因素

2.1 外植體和基本培養基的選擇

以孢子體為外植體，重要的是對外植體材料質量的選擇和審定。外植體材料生理和營養的不同可能會導致組織培養工作的混亂。經過在30余種培養基類型上的實踐證明，蕨菜不同類型的外植體中，以地下莖（根狀莖）最幼嫩的包括生長點在內的先端一小段，經過誘導才具有產生大量不定芽的能力[6]，也最易誘導形成愈傷組織。選擇配子體材料進行組織培養時，如果能獲得孢子，大多采用孢子作為外植體。

蕨菜組培應用的基本培養基大體有 MS、1/2 MS、Knop、N6等，在用孢子體材料作初代培養或繼代增殖階段應使用較高無機鹽濃度的基本培養基，1/2 MS最為常用。在孢子萌發、分化成苗、生根階段應使用低鹽濃度的基本培養基，如Knop、1/8 MS等，因為高鹽濃度往往抑制孢子萌發。全MS培養基對提高孢子的萌發量效果最佳。1/2 MS培養基則有利于蕨的組織培養中誘導出綠色小球GGB，進而誘導出叢生芽，分化出苗。但因蕨菜種類繁多，生育特性不同，對培養基成分的要求也有所不同：MS培養基對波士頓蕨和黑心蕨效果良好。

2.2 消毒方法對組織培養的影響

外植體消毒是組織培養技術的第一步基礎工作，也是最重要的步驟，消毒不徹底可能導致整個過程的成敗。植物組織培養中外植體的成活率與污染率不成一定的比例。蕨菜組織培養外植體消毒一般采用0.1%～1.0%HgCl2、70%～75%酒精等常用消毒劑。HgCl2雖然殺菌力強，但對外植體的傷害也很大，且不易去除，所以一般使用濃度不超過1.0%，而且要嚴格把握時間。李榮峰等[7]對蕨菜幼嫩莖段的消毒試驗表明，在消毒時間相同的前提下，隨著HgCl2濃度的遞增，污染率降低，成活率先增后減，在1.0%時達到最大值；在相同的HgCl2濃度下，隨著消毒時間的延長，污染率和成活率都呈下降趨勢。由此證明，高濃度、長時間的HgCl2消毒雖然降低了污染率，但同時也降低了成活率。另外，同樣的消毒時間和方法對不同大小的外植體效果也不同，將大塊的外植體消毒后再切成合適大小接種比把外植體切成合適大小消毒后再接種效果要好，并且成活率也較高。

2.3 外源激素對組織培養的影響

外源激素常用的有：植物生長素GA3、IAA、NAA或IBA；細胞分裂素BA、KT等。

孢子萌發期：GA3能有效打破孢子休眠，促進上一年常溫保存的孢子提早萌發，并能提高萌發率，而對當年的孢子只有促進提早萌發的作用，不能提高萌發率[8]。

愈傷組織誘導與增殖：在不含有任何激素的1/2 MS培養基中愈傷組織誘導率極低，向培養基中添加了6-BA、IBA、NAA后，誘導率與增殖率均有所提高。方利娟等[9]的試驗表明，0.2 mg/L的6-BA和0.4 mg/L的IBA或NAA是誘導愈傷組織的最佳濃度，這與周曉麗等[10]、華智銳等[11]的研究結果相近。而KT、Zip和Zeatin等細胞分裂素在適宜的水平均具有較好的誘導芽增殖的效果。

2.4 糖源對愈傷組織誘導及世代轉換的影響

在蕨類植物的組培中，一般以蔗糖為糖源，其次為葡萄糖。高濃度的糖會抑制孢子萌發，但加入適量的糖有利于原葉體的進一步生長發育。華智銳等[11]試驗表明，1/2 MS培養基中加入30 g/L的蔗糖，愈傷組織誘導率為20.6%，比蔗糖濃度15 g/L的誘導率高18.4%，但有關蔗糖的最佳濃度尚無定論。糖源對蕨類植物的世代轉換也有重要的影響。一般認為在無糖源或在低糖源水平的饑餓狀態下,容易誘導無孢子生殖，而含高濃度糖的培養基有利于無性生殖配子體的誘導。

3 存在的問題及發展趨勢

盡管蕨類植物有很多組織培養成功的報道，但真正用于大規模商業化生產的并不多。因為在目前的蕨類組織培養技術條件下，組培苗生長緩慢、污染嚴重、成活率低、成本過高、煉苗階段的小苗存活率低等，都是阻礙蕨類組培技術發展的突出問題。為此，國內外的學者將環境控制技術和組培技術有機的結合起來做了大量研究。

3.1 采用新技術

由于傳統的組培技術中使用的含糖培養基極易受到污染，日本千葉大學古在豐樹教授發明了一種全新的植物組培技術——無糖組培技術[12]，其優點是用CO2氣體代替常規培養基中的糖源作為組培過程中所需要的碳源，通過環境控制技術，為組培苗提供生長發育所需的光、溫、水、氣、營養等條件，避免了因污染而引起的損失，減少了生理及形態的異常。

3.2 改善培養方式

利用氣升式生物反應器[13]進行組織培養，是一種模仿蕨類植物自然生長環境的培養方式，以蕨菜在自然界里生長的土壤為基質，做適當調節，消毒滅菌應用于組織培養。它具有更強的抗雜菌能力，流動性也更為均勻，結構簡單易操作。目前，這種培養方式已用于蕨類生產。

3.3 通過培育健壯的組培苗、調控環境因素、選擇適宜的基質來提高蕨菜組培苗的成活率

近年來，多項組培新技術應運而生 ，如植物開放式組織培養、無糖組培技術（光獨立培養法）、多因子綜合控制技術、新型光源的應用等[14]，這些新技術彌補了傳統組培技術的缺陷，如能將其引入蕨類組織培養中，無疑將推動蕨類組培技術的創新和在生產中的應用。蕨菜種類繁多，還有許多有價值的蕨類植物需要通過組培技術進行研究和開發，以實現蕨菜高品質、低成本的規模化生產。

[1]郭宇蘭，陳宇.蕨菜孢子組織培養技術的研究[J].中國林副特產，2012（6）：32-33.

[2]劉瑞林，佟立君，王緒.蕨菜原葉體組織培養及植株再生[J].中國林副特產，2006（3）：12.

[3]方利娟，蘇仕林，蒲仕明.蕨菜組織培養技術的研究[J].安徽農業科學，2012（6）：3 239-3 240，3 262.

[4]姜長陽，寧淑香，于淼，等．蕨菜愈傷組織高效再生體系的建立[J]．園藝學報，2003（3）：343-345．

[5]吳春華，石元亮，王淼.蕨菜根狀莖的組織培養技術研究[J].園藝與種苗，2013（11）：41-44.

[6]趙彥芳，婁和林，雷秀云.山蕨菜組織培養的研究[J].遼寧大學學報，2000（1）：76-78.

[7]李榮峰，蒲仕明，方利娟.蕨菜組織培養的消毒方法比較[J].湖北農業科學，2013（16）：3 852-3 855.

[8]翟國燕，邊珂，賈克功，等.GA3及不同比例MS培養基對蕨菜孢子萌發的影響[J].中國蔬菜，2007（8）：21-23.

[9]方利娟，蘇仕林，蒲仕明.不同濃度激素對蕨菜愈傷組織誘導與增殖的影響[J].湖北農業科學，2012（2）：406-408.

[10]周曉麗，王宇，張明宇.不同濃度激素對蕨菜愈傷組織誘導與分化的影響[J].大連教育學院學報，2004（2）：70-71.

[11]華智銳，李小玲.激素和蔗糖濃度組合對蕨菜愈傷組織誘導的影響[J].江西農業學報，2015（2）：41-44.

[12]Kozai T,Kitaya Y,Fujiwara K.Collected papers on environmental control in Micropropagation [M].Chibaken:Chiba University Press,1994:384-568.

[13]Sheffield E,Douglas G E,Cove D J.Growth and development of fern gametophytes in an airlift fermenter [J].Plant Cell Reports,1997,16:561-564.

[14]岳嵐，張玉芳，何松林.植物組織培養新技術的應用現狀與發展趨勢[J].現代園林，2008（23）：48-51.

Research Status and Development Trendency on Tissue Culture Techniques of Ferns(Pteridium aquilinum)

HAN Xiguo1,REN Ying2,NIE Zhenbo3,GAO Jing4,WANG Qingjun4,WANG Xiaohui2
(1.Taonan Experiment Station,Jilin Academy of Agricultural Sciences,137100; 2.Research Institute of Agricultural Resources and Environment,Jilin Academy of Agricultural Sciences; 3.Lesheng Agricultural Technology Popularization Station in Da'an City of Jilin; 4.Guodian Agricultural Technology Popularization Station in Lishu County of Jilin)

Based on the present tissue culture techniques inPteridium aquilinum,the article exposed the influences of explants,medium components,disinfection methods and additives on the culture,and also analyzed and discussed the existing problems,development trend and prospects about tissue culture of ferns.

Pteridium aquilinum;Tissue culture;Effect factor;Development tendency

S647

：A

：1001-3547（2017）16-0030-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.16.013

基于組培育苗的長白山區野生蕨菜馴化及高產高效栽培技術（20170204046NY）

韓喜國（1967-），男，副研究員，研究方向為作物栽培，電話：17604466868，E-mail：hanxg1967@sohu.com

王曉慧，通訊作者，副研究員，研究方向為山野菜馴化及栽培

2017-05-24