造船廢油對海水中微生物數量和酶活性的影響

袁翼　李土建　顧得月　熊妍妍　劉雪珠　李鵬

摘要：實驗室條件下，在28 d周期內研究了不同濃度（0、0.05、0.15、0.45、1.35 mg/L）的含油廢水對海水中微生物數量和酶活性的影響。結果表明，海水中的微生物數量隨著含油廢水污染時間和濃度的不同，表現出不同的變化特征。在培養過程中，細菌數目在7 d時達到最大值，之后開始呈緩慢下降的趨勢，其中7 d時含油濃度為0.15 mg/L的處理數量增長最為明顯；在培養過程中放線菌一直保持增長的趨勢，濃度為0.45 mg/L的處理在28 d時放線菌數量明顯超過其他濃度處理；在整個培養過程中霉菌與酵母菌數量極少。含油廢水對海水中微生物脫氫酶和超氧化物歧化酶（SOD）的誘導作用不同。微生物的脫氫酶活性在0～14 d內緩慢上升，至14 d時達到最大，其后隨著時間推移脫氫酶活性逐漸減弱。而SOD酶活性在28 d的培養期內呈先下降后回升并緩慢升高的趨勢，且不同濃度的含油廢水油污染對海水中微生物SOD酶活性的影響差異不顯著（P>0.05）。

關鍵詞：含油廢水；微生物數量；酶活性

中圖分類號：X55；Q938.8 文獻標識碼：B 文章編號：0439-8114（2017）04-0645-05

目前國內開展的關于溢油污染對海洋生態系統影響的研究主要集中在貝類、無脊椎動物、魚類以及海鳥和哺乳動物等方面[1，2]。也有大量研究集中在海洋細菌對海洋溢油污染物的生物降解上，如石油降解菌的分離、純化和篩選、石油降解菌的降解效率以及海洋石油污染的生物修復等方面[3-5]，很少涉及石油污染對海洋微生物消長規律及微生物酶活性的影響[6]。

造船產業是國民經濟中的重要組成部分。船廠在對船舶進行機械加工、部件預舾裝、碼頭舾裝、試驗和試航時產生的廢水中含有較高濃度的油，含油廢水被排到海水中后，油層覆蓋了水面，阻止空氣中的氧向水中擴散。由于水體中溶解氧減少，藻類的光合作用受到了限制。同時，廢水中的油除了刺激烴降解微生物的生長外，還會引起油污染海域微生物數量、群落結構組成和微生物酶活性等方面的變化，并最終影響海洋生態系統的次級生產過程[7，8]。

本研究以舟山某造船廠廢油為試驗用油，遠離造船廠近海表層水為試驗用水。于實驗室條件下，研究含油海水與海水中微生物數量對應關系及其對酶活性的影響，為初步建立含油廢水污染對海洋次級生產過程影響的評估體系奠定基礎，并為油污染海域自身修復能力和含油廢水污染治理提供科學依據和決策參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗海水采自遠離造船廠近海表層海水，樣品采集參照《海洋生物生態調查技術規程》方法[9]。

試驗用油為舟山某造船廠廢油。由于油難溶于水，為使油均勻分散到海水中，首先制備飽和含油海水（母液），用于研究重油在水相中穩定存在的小油珠和溶解成分對異養細菌的影響。母液制備方法：在無菌海水（0.22 μm濾膜過濾）中滴加過量試驗用油，將混合液置于磁力攪拌機上，連續攪拌24 h后靜置約6 h，用分液漏斗分離出下層水相即為飽和的含油海水（母液）。

1.2 方法

1.2.1 母液濃度測定 采用紫外分光光度法測定[10]：①油標準貯備液（1 000 mg/L），準備稱取100 mg標準油于燒杯中，加入少量石油醚，溶解。全量轉移到100 mL容量瓶中，并稀釋至標線，混勻。②油標準使用液（50 mg/L），移取5 mL油標準貯備液于100 mL容量瓶中，用石油醚稀釋至標線，混勻。

分別配制10、20、30、40、50 mg/L的系列標準樣品，用1 cm光程石英比色皿以石油醚為空白參比，在256 nm波長處依次測定上述樣品的吸光度值，繪制標準曲線y=0.001 0x-0.000 2，R2=0.998 7。根據標準曲線計算出母液濃度為22.5 mg/L；根據母液測定結果及海水水質標準，設置處理濃度為0、0.05、0.15、0.45、1.35 mg/L，并按20 mg/L和10 mg/L加入NH4NO3和KH2PO4作為無機營養鹽[11]，每個濃度分裝100 mL水樣于250 mL錐形瓶中。將設置好的5個濃度組置于28 ℃、120 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養。分別于0、7、14、21、28 d進行取樣測定。

1.2.2 海水初始狀態下微生物數量檢測 采用熒光顯微鏡計數法檢測海水初始狀態下的微生物總數[12-14]：①取一張0.2 μm微孔濾膜，使膜光滑面朝上平貼于濾器底部；②搖勻樣品，吸取0.25 mL菌液注入濾器內，同時加入0.375 mL無菌沖洗水，加2～3滴丫啶橙染液染色3 min，手動抽濾染色液，使微生物留于濾膜上，用無菌水沖洗數次，再將濾液抽干；③取下濾器，用鑷子將濾膜移到載玻片上，滴一小滴香波油，在熒光顯微鏡下觀察計數；④觀察并計數3個裝片共30個視野下微生物數目，并按下列公式計算初始狀態下海水中微生物總數：E=X■·V，式中，E表示樣品中微生物數量（ind/mL）；X表示各視野中細菌總數的平均值（個）；S1表示濾膜面積（mm2）；S2表示顯微鏡視野面積（mm2）；V表示過濾菌液體積（mL）。

1.2.3 可培養異養微生物計數 可培養異養細菌數測定方法用Zobell 2216E培養基稀釋平板法培養并計數[15]，可培養異養放線菌數測定方法用高氏一號培養基稀釋平板法培養并計數，可培養異養霉菌及酵母菌數測定方法用PDA培養基稀釋平板法培養并計數。

1.2.4 脫氫酶及SOD酶活性測定 脫氫酶活性測定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法[16，17]，其原理是無色的TTC在細胞呼吸過程中替代O2-作為人為受氫體，接受H+后被還原成紅色的三苯基甲臜（TF），通過測定TF吸光值大小反映細胞活力大小，樣品前處理采用文獻[18]方法。超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用改良的鄰苯三酚自氧化法（325 nm法），細胞破壁采用助溶劑破壁法[19，20]。

1.3 數據處理及分析

數據分析在SPSS 17.0中進行，采用方差分析和LSD比較不同廢油濃度、不同培養時間微生物數量及生物酶活性的差異性。相關圖表制作通過Excel 2010完成。

2 結果與分析

2.1 海水初始狀態下微生物數量的檢測

為檢測海水初始狀態下微生物總數，通過觀察熒光顯微鏡下30個不同視野，得X=16個，S1=491 mm2，S2=7.2×10-3 mm2，V=0.25 mL，數據代入公式，可得E=4.36×106 ind/mL[21]，觀察結果如圖1所示。由于經熒光染色后在觀察時肉眼無法分辨死細胞及無生命顆粒，故正常情況下計算所得數值往往較實際可培養異養微生物總數高幾個數量級。

2.2 不同濃度含油廢水對海水中細菌數量的影響

不同含油濃度條件下海水中細菌的數量隨時間的變化見圖2。從圖2可以看出，在培養過程中不同的培養時間所有處理細菌數目均呈現先上升后下降的趨勢。在最初培養的7 d內各組均大幅度增長，而以含油濃度為0.15 mg/L的處理數量增長速度最快。各組均于7 d時細菌數量達到最大值，且可測得的各處理細菌數量顯著高于對照組（P<0.05）。其原因可能是石油進入海水一段時間后，刺激能夠利用石油烴作為C源并參與石油烴降解細菌的生長，導致其大量增殖，而石油污染對細菌生存的影響存在一個最適濃度。

而在7～14 d的培養時間內，各組細菌數量均呈明顯下降趨勢，表明長時間的含油環境對細菌生長有抑制作用。之后各組均緩慢上升，至28 d時，數值達到相對穩定，各組之間沒有顯著性差異（P>0.05），且各處理數值均高于對照。其中，最高濃度（1.35 mg/L）海水中的細菌數在14～21 d時曾下降至無，可能是由于高濃度的溢油污染對細菌的生長產生了抑制作用，之后又逐漸上升，至28 d試驗結束時，其數值較對照組明顯上升，但低于其他濃度組，推測是由于某些細菌對石油烴的降解作用所致。

已有研究表明，環境中可培養石油降解菌數與石油濃度呈密切正相關[22，23]。李博等[22]的研究表明，在石油污染的海水中，可培養異養細菌的數量先是呈增長趨勢，在第7天時達到最大值，然后逐漸減少。這與本試驗結果一致，石油污染后，可培養異養菌數短期內先增長后降低，較長時間后，逐漸恢復。另有研究表明，細菌中的多個屬的菌類對石油烴具有不同程度的降解能力[24-26]。

2.3 不同濃度含油廢水對海水中放線菌數量的影響

在培養過程中放線菌的數量隨培養時間的變化如圖3所示，放線菌數量一直保持增長的趨勢，且在21 d及21 d之前處理與對照放線菌數量無顯著性差異（P>0.05），含油濃度為0.45 mg/L的處理在28 d時放線菌數量顯著高于其他處理（P<0.05），故推測放線菌比細菌耐受性更好，可適應更高濃度的石油污染。而經用PDA培養基分離培養表明所取海水中霉菌與酵母菌數量極少。

對于放線菌類而言，在長期培養過程中處理放線菌數總體呈上升趨勢，而且隨著時間推移，含油濃度越高（在低于1.35 mg/L時），這種趨勢越明顯。這也證明了放線菌對石油烴類具有強大的降解作用[27-32]，但到目前為止，針對放線菌與石油污染及其對石油降解的應用研究還很少，值得進一步探索。

2.4 不同濃度含油廢水對海水微生物脫氫酶活性的影響

在海水中加入不同濃度的含油廢水后，海水中微生物脫氫酶活性隨時間變化特征如圖4所示。在0～7 d內各處理微生物脫氫酶活性緩慢上升，脫氫酶活性顯著高于對照（P<0.05）。推測石油污染物誘導了細菌脫氫酶的產生。7～14 d內，除含油濃度為0.05 mg/L的處理大幅度升高，顯著高于其他處理（P<0.05），脫氫酶活性達到最大值外，其余0.15、0.45、1.35 mg/L濃度處理組，均呈小幅度下降趨勢，其后隨著時間推移，14～28 d試驗過程中脫氫酶活性逐漸減小，除28 d時濃度為0.05 mg/L的處理脫氫酶活性高于對照外，其余處理均小于對照。推測不同濃度的含油廢水對脫氫酶誘導的作用程度不同，高濃度的含油廢水反而較快抑制了脫氫酶的活性。

脫氫酶是微生物體內參與石油烴類氧化分解的重要酶類，脫氫是石油降解或轉化的首要步驟。已有研究表明脫氫酶與石油烴降解有良好的相關性[33，34]，通常能反映微生物對石油污染的適應情況。本試驗結果顯示，各處理脫氫酶活性均呈先上升后下降趨勢，且7 d后含油濃度為0.05 mg/L的處理脫氫酶活性明顯高于其他處理。推測石油污染發生后，有關石油降解菌增殖，從而導致與石油降解有關的菌株脫氫酶活性增強，且較低濃度的含油廢水能更好地誘導油降解菌產生大量脫氫酶，使得脫氫酶活性顯著升高。之后，隨著石油被逐步降解，脫氫酶活性也緩慢降低到穩定水平。

2.5 不同濃度含油廢水對海水微生物SOD酶活性的影響

在海水中加入不同濃度的含油廢水后，海水中微生物SOD酶活性隨時間變化特征如圖5所示。在28 d的培養期內各處理SOD酶活性呈先下降后回升并持續緩慢升高的趨勢，0～7 d內不同濃度的含油廢水對海水中微生物SOD酶活性的影響差異不顯著（P>0.05），只有濃度為0.05 mg/L的處理SOD酶活性出現下降趨勢；而在7～14 d內，各個處理SOD酶活性下降程度不大；隨后SOD酶活性至21 d時稍有上升，至試驗結束各處理SOD酶活性已保持相對穩定。

不考慮偶然因素，可以推測微生物對海水中施加的重油污染成分需要較長時間的適應期，并在適應期過后，重油可以刺激并誘導微生物SOD酶的生物合成。但從培養后期SOD酶活性升高的趨勢來看，這種誘導作用是十分微弱的。目前為止，國內外有諸多關于石油污染物對海洋生物抗氧化酶系統毒性效應的研究[33-36]，但較少見石油污染對海洋微生物SOD酶活性的研究。SOD酶是生物抗氧化系統的重要酶類，其活性對維持細胞正常生命活動具有重要意義。與脫氫酶相比，重油污染對SOD酶的促進作用要小很多，在所設計濃度范圍內，僅在14 d時有小幅回落而后緩慢上升。Christian等[37]在原油污染對大鼠抗氧化酶的作用中發現，當給原油超過6 mL/kg時其SOD酶活性明顯上升，而在給原油3 mL/kg時其SOD酶活性變化不明顯。

3 小結

1）被含油廢水污染后，海水中可培養異養微生物數目（細菌及放線菌）隨時間推移和含油濃度的不同而變化。從28 d周期來看，可培養異養細菌數目總體呈先升高后下降的變化趨勢，7 d時各處理細菌數量大幅度上升，其中以0.15 mg/L濃度處理增長最為迅速，7 d后細菌數量明顯下降，至試驗結束各處理數量保持相對穩定。本試驗中0.15 mg/L濃度的含油廢水對細菌生長有較明顯的促進作用，而超過或低于該濃度其促進作用減弱。總體顯示含油廢水污染發生后，細菌對其的自凈能力是有限的。

長期培養放線菌的過程中，放線菌數量一直保持上升趨勢。7 d之前放線菌基數極小，至7 d時各處理放線菌數量開始逐步上升。此外，放線菌數量14 d后出現快速增長，其在含油廢水污染環境中的耐受力比細菌更好，但其對廢油的適應能力及降解修復能力值得進一步研究。

2）較低濃度（本試驗中0.15 mg/L）的含油廢水可促進海水中可培養異養微生物脫氫酶的大量合成，且含油濃度為0.15 mg/L時，這種促進作用最為明顯。但從21 d開始至試驗結束，各組脫氫酶活性均維持在較低水平，且對照與各處理間無顯著性差異（P>0.05）。顯然，在0.05～1.35 mg/L濃度范圍內和0～14 d時間內，含油廢水對脫氫酶具有誘導作用，但一旦濃度過高或作用時間過長，則其誘導作用就不明顯并開始減弱。相較于SOD酶，脫氫酶對含有廢水的刺激更為敏感，是否可將脫氫酶活性作為檢測海洋受廢油早期污染的一個生理檢測指標值得研究。

相比脫氫酶，各組濃度的含油廢水對海水中微生物SOD酶活性的影響差異性不顯著（P>0.05）。在所有設計濃度范圍內各組SOD酶活在14 d時有小幅下降現象，21 d至試驗結束，對照與各處理SOD酶活性亦無顯著性差異（P>0.05），說明含油廢水污染對海水微生物SOD酶活性的影響較小。SOD酶對海洋廢油的這種遲鈍反應是否可以作為檢測海洋受重度廢油污染的一個生理檢測指標有待于進一步研究。

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