產果膠酶疣孢青霉菌株TS63—9發酵條件優化及其在煙草中的應用

賀兆偉　奚家勤　李玉娥　金洪石　金江華　宋紀真

摘要：為考察碳源、培養時間、溫度、起始pH等因素對產果膠酶疣孢青霉（Penicillium verruculosum Peyron.）菌株TS63-9發酵產酶的影響，對該菌株發酵條件進行了優化，并考察了最優發酵條件下粗酶液在煙絲中的應用效果。結果表明，TS63-9液體發酵最佳碳源為煙梗粉末，添加量7.5 g/L；最適培養溫度為28 ℃，最適起始pH為6.0；經優化后，在搖床轉速200 r/min條件下培養72 h，粗酶液果膠酶活性達到832.49 U/mL。將此粗酶液添加應用于煙絲后，可顯著降低煙絲果膠含量，感官質量得到一定程度改善；通過掃描電鏡觀察煙絲表面細胞排列特征，發現細胞間隙變大，細胞間隙比例提高。

關鍵詞：疣孢青霉（Penicillium verruculosum Peyron.）；果膠酶；發酵條件優化；煙絲；感官品質

中圖分類號：TQ925+.3：TS41 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）04-0686-05

果膠質是組成細胞壁結構的成分之一，是一種存在于相鄰細胞壁間將細胞粘著在一起的親水性膠體物質。果膠質對煙葉的吸濕性和彈性有一定的作用，但含量過高時會導致焦油生成量的增加[1]。另外，果膠是卷煙煙氣中甲醛、乙醛等揮發性羰基化合物的一種重要前體物，而甲醛是一種I類致癌物，乙醛具有纖毛毒性，可減少肺巨噬細胞的數量[2-4]。Zhou等[5]通過模擬卷煙陰燃的條件對果膠的裂解行為進行了分析，檢測出裂解氣體產物主要包括CO2、H2O、CO、甲醇、甲烷以及揮發性羰基化合物。降低煙葉中的果膠質含量不僅可改善煙葉品質，而且可減少焦油生成量及煙氣有害成分。采用商品化的果膠酶或者產果膠酶微生物及發酵液均可以降解煙草中的果膠。于建軍等[6]將果膠酶的水溶液噴于煙絲上，有效地降低了煙絲中的果膠含量，并提高了中性香味物質的總量。鄧國賓等[7]利用從優質煙葉中分離的產果膠酶黃曲霉（Aspergillus flavus Link）DPE-005菌株發酵產生的酶液來處理上部烤煙，結果改善了上部煙的吸味品質。另外，醇化片煙中的微生物在煙葉的醇化過程中起著重要的作用[8]。試驗從醇化片煙中篩選出一株產果膠酶疣孢青霉（Penicillium verruculosum Peyron.）菌株TS63-9[9]，對該菌株的發酵產酶條件進行了優化，并考察了發酵粗酶液在煙絲中的應用效果，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料 產果膠酶疣孢青霉菌株TS63-9[9]系本實驗室從廣西壯族自治區賀州市生產的B2F醇化片煙分離而得，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號：CGMCC NO.6747。煙葉樣品為云南省昌寧縣2014年初烤煙葉，品種為紅花大金元，等級為C3L，采用QS-5實驗室煙葉切絲機制備煙絲樣品。

1.1.2 試劑及儀器 試劑主要有果膠（美國Sigma-Aldrich公司）、D-半乳糖醛酸（純度97%，美國Sigma-Aldrich公司）、DNS試劑（3，5-二硝基水楊酸10 g，氫氧化鈉10 g、酒石酸鉀鈉200 g，苯酚2 g、無水亞硫酸鈉5 g，用去離子水定容至1 000 mL，棕色瓶貯存；苯酚重蒸，其余為化學分析純）、果膠酶（Pectinase，活性≥50 000 U/g，BioDEE）。儀器主要有UV-2300紫外分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）、生化培養箱、振蕩培養箱、冷凍離心機（日本Hitachi公司）、AA3連續流動分析儀（德國布朗盧比公司）、TM3000臺式掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.1.3 基礎產酶培養基 成分為果膠5 g/L、蛋白胨 1.0 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、（NH4）2SO4 1.4 g/L、尿素 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、CaCl2 0.3 g/L、FeSO4·7H2O 0.005 g/L、MnSO4·H2O 0.001 56 g/L、ZnSO4·7H2O 0.001 4 g/L、CoCl2·6H2O 0.002 g/L，pH 6.0[10]。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備 疣孢青霉菌株TS63-9劃線接種于PDA斜面培養基上，28 ℃培養48～72 h，加入無菌水振蕩后得到孢子懸浮液（孢子濃度106個/mL），將孢子懸浮液以5%的接種量接入盛有30 mL產酶培養基的250 mL三角瓶中，在28 ℃、200 r/min的條件下搖瓶發酵72 h；發酵產物在4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 果膠酶活性測定 采用DNS顯色法[11]測定果膠酶活性，在10 mL具塞刻度試管中加入1.0 mL 0.5%果膠溶液（pH 4.0檸檬酸緩沖液配制），加入0.5 mL粗酶液，55 ℃水浴反應40 min后，加入3 mL DNS溶液，沸水浴10 min，取出后用自來水迅速冷卻至室溫，定容至10 mL。以滅活酶液為對照，在540 nm處測定吸光度，根據半乳糖醛酸標準曲線計算還原糖含量。在上述反應條件下，以每小時水解果膠底物產生1 mg半乳糖醛酸的酶量為1個酶活性單位，用U/mL表示。

1.3 發酵條件優化

分別以碳源、培養時間、溫度、起始pH為因素進行單因素試驗，比較對疣孢青霉菌株TS63-9發酵產酶的影響。

1.3.1 碳源種類對菌株發酵產酶的影響 在產酶培養基中，分別用5 g/L的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、D-半乳糖醛酸、玉米粉、麩皮、橘皮粉、煙梗粉末代替果膠作為碳源，接種疣孢青霉菌株TS63-9，在28 ℃、200 r/min條件下培養72 h，測定不同碳源種類對果膠酶活性的影響，以確定最適合碳源。

1.3.2 碳源濃度對菌株發酵產酶的影響 將碳源濃度分別設為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g/L，接種疣孢青霉菌株TS63-9，在28 ℃、200 r/min條件下培養72 h，測定不同碳源濃度對果膠酶活性的影響，以確定最佳碳源濃度。

1.3.3 培養時間 將疣孢青霉菌株TS63-9接種于最佳碳源的產酶培養基中，在28 ℃、200 r/min條件下進行液體發酵，每隔24 h測定一次果膠酶活性，比較培養時間對發酵產酶的影響。

1.3.4 溫度 將疣孢青霉菌株TS63-9接種于最佳碳源的產酶培養基中，分別于20、24、28、32、36、40 ℃環境里、搖床轉速200 r/min的條件下培養72 h，測定不同溫度對果膠酶活性的影響。

1.3.5 起始pH 分別調節培養基起始pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接種疣孢青霉菌株TS63-9后，在28 ℃、200 r/min條件下培養72 h，測定不同起始pH對發酵產酶的影響。

1.4 粗酶液應用效果分析

1.4.1 粗酶液應用方式 煙絲于22 ℃、相對空氣濕度60%條件下平衡48 h以上，按照表1的試驗設計，用喉頭噴霧器（接空壓泵）將最優發酵條件下獲取的粗酶液均勻噴于煙絲上，每個處理重復3次。噴后置于塑料袋內密封，放于烘箱中40 ℃條件下處理8 h，再80 ℃處理20 min，使酶失活。

1.4.2 測定項目及方法 取少量樣品于40 ℃干燥12 h，磨碎過40目篩后測定果膠含量[12]，根據文獻[13]測定煙末含水率。參照文獻[14]要求，由鄭州煙草研究院評吸專家委員會對樣品進行感官質量評吸，并進行定性描述。利用TM3000掃描電鏡觀察煙絲表面細胞排列特征，用Photoshop CS5軟件對所得電鏡圖片進行處理，計算細胞間隙的比例[15]。

1.5 數據處理

試驗所得數據采用Microsoft Office Excel 2007程序處理，并用其制表和繪圖；運用SPSS 22統計軟件進行Duncan′s 新復極差法多重比較。

2 結果與分析

2.1 疣孢青霉菌株TS63-9發酵條件的優化

2.1.1 碳源種類及濃度對菌株產酶能力的影響 不同碳源對疣孢青霉菌株TS63-9產酶能力的影響情況見表2。從表2可見，TS63-9在供試碳源中均能產生果膠酶，但不同碳源的果膠酶活性有很大差異。以葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖醛酸、可溶性淀粉作為惟一碳源時，發酵液的果膠酶活性均低于10 U/mL；以成分較復雜的玉米粉、麩皮作為惟一碳源時，酶活性有所提高；而以果膠、橘皮粉、煙梗粉末作為惟一碳源進行發酵后，酶活性大大提高，尤其以煙梗粉末作為碳源的產酶效果最好，果膠酶活性達到了814.32 U/mL，與其他碳源的差異均達到了極顯著差異（P<0.01）。果膠酶是一種誘導酶，利用真菌進行液體發酵時，一定量的含果膠底物有利于產果膠酶。煙梗作為煙草工業的副產物，較易獲得，且含有的成分和種類與煙葉基本一致，因此選用煙梗粉末作為果膠酶液體發酵底物是最佳的選擇。

不同添加量的煙梗粉末對疣孢青霉菌株TS63-9產果膠酶能力的影響情況見圖1。從圖1可見，當煙梗粉末添加量為7.5 g/L時，果膠酶活性最大；而當添加量高于7.5 g/L時，果膠酶活性變化不大，且隨著繼續增加呈現出下降的變化趨勢；說明煙梗粉末添加量在7.5 g/L時是最合適的。

2.1.2 培養時間對菌株產酶能力的影響 培養時間對疣孢青霉菌株TS63-9產酶能力的影響情況見圖2。從圖2可見，在搖瓶發酵前期，由于孢子數量相對較少，代謝活動較弱，酶活性非常低；隨著培養時間延長，酶活性急劇升高，在72 h時達到最高值。隨后隨著營養物質的消耗以及菌株代謝活動的減弱，酶活性趨于穩定，整體上呈現出逐漸降低的變化趨勢。

2.1.3 溫度對菌株產酶能力的影響 培養溫度對疣孢青霉菌株TS63-9產酶能力的影響情況見圖3。從圖3可見，疣孢青霉菌株TS63-9在不同的培養溫度下產酶能力有較大的差異，果膠酶活性隨著溫度的升高而變化大，在28 ℃時達到最大值，此時TS63-9的產酶能力最強。但隨著培養溫度繼續升高，酶活性顯著降低，產酶能力減弱。

2.1.4 培養基起始pH對菌株產酶能力的影響 培養基起始pH對疣孢青霉菌株TS63-9產果膠酶的影響情況見圖4。從圖4可見，菌株在pH 5.0～7.0具有較強的產酶能力，以pH為6.0時果膠酶活性最高，而pH大于7.0或者小于5.0均不利于菌株產果膠酶。

2.1.5 優化的發酵條件測粗酶液果膠酶活性 將上述單因素試驗得到的最佳條件（碳源為煙梗粉末7.5 g/L，最適培養溫度為28 ℃，最適起始pH為6.0，在搖床轉速200 r/min條件下培養72 h）組合在一起，測定疣孢青霉菌株TS63-9粗酶液的酶活性，結果粗酶液的果膠酶活性達到832.49 U/mL，比果膠為底物的果膠酶活性227.56 U/mL提高了約2.66倍。

2.2 TS63-9果膠酶在煙絲中的應用效果

2.2.1 粗酶液對煙絲果膠含量的影響 疣孢青霉菌株TS63-9粗酶液添加應用于煙絲后，對煙絲果膠含量的影響情況見圖5。從圖5可見，與空白對照相比，噴施TS63-9發酵粗酶液能不同程度地降低煙絲中的果膠含量。其中T2、T4、T6處理的果膠含量分別為7.99%、5.39%、4.96%，比對照的果膠含量9.03%分別減少了11.5%、40.3%、45.1%，隨著酶液添加量的增多而減少，與對照差異極顯著（P<0.01）；T1、T3、T5處理的煙絲果膠含量與對照相比幾乎沒有發生變化，差異不顯著（P>0.05），說明高溫使酶失活，失去了降解果膠的能力。另外，T4、T6處理與T2處理相比，果膠含量變化明顯，差異極顯著（P<0.01）；而T4與T6處理之間差異不顯著（P>0.05），可見酶添加量達到一定的水平后，果膠含量減少的趨勢在變緩。

2.2.3 粗酶液對煙絲感官評吸質量的影響 具有疣孢青霉菌株TS63-9粗酶液正常酶活性的處理對煙絲感官質量的影響情況見表3。從表3可見，不同處理煙絲的感官質量整體差異不大，屬于“中等”檔次。其中，T2處理的煙絲與對照相比感官品質沒有發生變化；T4處理與對照相比感官質量明顯變好，表現為香氣量有所增加，相對飽滿，濃度增加，煙氣濃郁；而T6處理與對照相比感官質量有所下降，主要表現為刺激性增大，可能是由于粗酶液添加量過多、導致煙葉化學成分變化較大、影響了內在成分的協調性所致。

2.2.4 煙絲表面細胞形態結構特征的掃描電鏡觀察 疣孢青霉菌株TS63-9發酵粗酶液應用于煙絲后，果膠含量明顯降低，其表面細胞排列結構也發生了變化；不同處理煙絲表面掃描電鏡圖像情況見圖6。從圖6可以看出，對照以及T1、T3、T5處理的細胞排列緊密，T2、T4、T6處理的表面細胞排列疏松，細胞間出現間隙，且空隙的平均大小隨粗酶液添加量的增多而變大。利用Photoshop CS5圖像處理軟件計算放大600倍的圖像中細胞間隙比例，結果見圖7、表4。由圖7、表4可以看出，經粗酶液處理后，煙絲表面細胞的間隙比例明顯變大，T2、T4、T6處理的細胞間隙比例分別比對照提高了53.30%、84.14%、112.94%。

3 小結與討論

1）通過對產果膠酶疣孢青霉菌株TS63-9發酵條件優化試驗，獲得了其液體發酵優化條件為碳源煙梗粉末7.5 g/L、培養溫度28 ℃、培養基起始pH 6.0、在搖床轉速200 r/min條件下培養時間72 h，其余不變。在此條件下，TS63-9果膠酶活性為832.49 U/mL，比優化前提高了約2.66倍。說明煙梗粉末作為碳源對TS63-9產果膠酶有很大的影響，能夠大大提高菌株的產酶能力。在微生物發酵產果膠酶時，以往多利用水果殘渣如檸檬皮[16]、橘皮[17]，玉米漿[18]以及甜菜渣[19]等復合基質代替果膠作為碳源，而以煙草基質為底物進行發酵產果膠酶的相關研究未見報道。

2）在最優發酵條件下獲得的疣孢青霉菌株TS63-9發酵粗酶液處理煙絲后，煙絲的果膠含量明顯降低；感官品質在一定程度上得到改善，主要表現為香氣量有所增加，煙氣濃度增大，飽滿濃郁；利用掃描電鏡觀察煙絲表面細胞排列特征，發現處理后煙絲細胞間隙變大，細胞排列更加疏松。

3）果膠作為一種大分子物質，與卷煙煙氣中多種有害成分有關，關于疣孢青霉菌株TS63-9對卷煙煙氣中相關有害成分含量的影響，有待下一步深入試驗，并且TS63-9發酵粗酶液的安全性評價也需同步研究。

4）試驗是在實驗室條件下對微生物降解煙絲果膠含量進行了初步探索，作用條件及應用范圍與實際生產還存在一定差異；下一步將模擬卷煙生產工藝，結合制絲工序，進一步探討添加量、時間、溫度等條件對疣孢青霉菌株TS63-9果膠酶降解煙草（煙葉、煙梗等）果膠含量的影響。

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