閔行地區PRRSV的分離鑒定及N基因序列分析

邢濤　郁星星　張峻　周光勝　張紅飛　朱愛軍

摘要：采集閔行地區規模豬場疑似PRRS陽性病料，在Marc-145細胞上進行病毒分離，采用RT-PCR擴增PRRSV高度保守的N基因并測序。結果表明，成功分離到6株PRRSV，為研究閔行地區PRRSV流行株分子變異和致病機理提供了良好的生物素材。

關鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；N基因；分離與鑒定；序列分析

中圖分類號：S828 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）04-0704-03

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬的烈性傳染病，是全球養豬行業最重要的疾病[1，2]。研究表明，ORF7編碼的核衣殼N蛋白在同型的不同毒株中最為保守，是PRRSV免疫原性最強的結構蛋白[3，4]，Lee等[5]研究表明N蛋白的核定位與病毒的持續感染或選擇變異具有一定相關性，在病毒的免疫逃避中扮演著重要角色，因此，N蛋白以其高度的保守性和強大的免疫原性成為診斷PRRS的首選蛋白。本研究克隆并測序其相對保守的N基因，通過序列分析軟件與國內外參考毒株進行推導氨基酸序列比較以及同源比對分析，探討閔行地區PRRSV優勢流行毒株的類型，以期為科學預防PRRS提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 試驗樣品為2015年采集閔行地區正義牧場（疫苗株Ingelvac PRRS MLV）、中南牧場（疫苗株TJM-F92）兩個規模豬場發生高熱、咳喘、繁殖障礙等豬繁殖與呼吸綜合征疑似病豬的肺臟、脾、扁桃體。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基為Gibeo公司產品；Trizol、dNTPs、pMD18-T、限制性內切酶、DNA Marker均為寶生物工程（大連）有限公司產品；膠回收試劑盒為Fermentas公司產品；M-MLV Reverse Transcriptase為Promega公司產品。

1.1.3 引物 根據李鵬等[6]的研究設計1對特異性引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物序列為：上游引物P1：5-GCGGATCCCCAAATAACAAC GGCAAGC-3，下游引物P2：5-GCAAGCTTCACCA TGCTGAGGGTGATG-3，預期擴增基因片段為372 bp。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 按照Trizol reagent試劑盒說明書提取病毒RNA，加入20 μL DEPC水溶解RNA，同時設未接種病毒的細胞作陰性對照。

1.2.2 N基因的RT-PCR擴增 按照One Step RT-PCR Kit說明進行cDNA合成，以合成的cDNA為模板擴增目的片段，反應體系為cDNA 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，ddH2O 18.5 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共進行35個循環；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3 目的基因克隆、鑒定與測序 PCR擴增產物按Fermentas膠回收試劑盒說明書進行回收純化，與pMD18-T載體連接，堿裂解法提取質粒，BamH Ⅰ+Hind Ⅲ酶切鑒定后由寶生物工程（大連）有限公司進行序列測定。

1.2.4 序列分析 對測序得到的基因序列利用MegAlign軟件進行分析[7]，與國內第一分離株CH-1a、河北分離株HB-2、美洲型參考毒株JXA1、美洲型經典株VR-2332及歐洲經典株LV進行氨基酸序列比對，并與參考毒株進行同源性分析。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR擴增與重組質粒酶切鑒定結果

PCR擴增產物電泳后出現與預期片段大小相符的條帶，約372 bp（圖1）， 陽性質粒經BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定后，得到預期大小372和2 690 bp的條帶（圖2）。

2.2 基因序列測定

將含有N基因的陽性質粒送至寶生物工程（大連）有限公司進行序列測定，結果表明，測序序列確為PRRSV核蛋白N基因序列，該基因全長372 bp，不存在缺失現象，編碼123位氨基酸，將其命名為MH1、MH2、MH3、MH4、MH5和MH6株。

2.3 氨基酸序列分析

ORF7編碼的N蛋白基因是PRRSV所有基因中最高度保守的[8]，但通過對N基因推導氨基酸序列分析表明，MH1-6株與JXA1株N基因氨基酸序列完全一致，與VR-2332株相比發生的氨基酸位點突變為：11R→K、15D→N、46K→R、91T→A、109H→Q、117V→A與CH-1a株相比發生了6個氨基酸位點的點突變：9R→Q、46K→R、49S→N、91T→A、109H→Q、117V→A與HB-2株相比發生了10個氨基酸位點的突變：11R→Q、15D→N、46N→R、48R→K、49S→N、61E→D、91S→A、101A→T、109H→Q、117V→A（圖3）。

2.4 同源比對分析

運用DNAMAN軟件對已獲得的6個N基因序列與其他參考毒株進行同源性分析。結果表明，MH1、MH2、MH3、MH4、MH5和MH6株之間同源性高達100%，說明各分離株之間N基因高度同源。MH1-6株與VR2332、CH-1a、HB-2株的同源性為91.9%～95.1%，與JXA1株的同源性高達100%，而與歐洲型代表株LV株的同源性為43.7%，表明閔行地區分離到的6株PRRSV毒株與JXA1變異株高度同源。

3 小結與討論

序列分析表明，閔行地區PRRSV毒株N基因編碼的氨基酸序列與國內分離的PRRSV非變異株（CH-1a和HB-2）氨基酸序列相比存在著一定的共同點突變，這種一致性的共同點突變為46K（N）→R、91T（S）→A、109H→Q、117V→A，然而這種一致性的點突變差異是否與閔行地區PRRSV毒株的毒力有關還有待進一步驗證。

同源分析表明，6株閔行分離株N基因序列之間同源性高達100%，提示閔行地區分離到的PRRSV毒株遺傳關系很近，很可能處于同一遺傳進化分支。MH1-6株與美洲型參考毒株JXA1變異株同源性高達100%，而與歐洲型經典株LV株的同源性僅為43.7%，提示閔行分離株可能為美洲型HP-PRRSV變異毒株，因此，對閔行地區進行PRRSV分子流行病學監測對PRRS防控具有重要意義[9]。

從閔行地區分離到的MH1、MH2、MH3、MH4、MH5和MH6毒株在豬繁殖與呼吸綜合征研究中具有一定的代表作用，本研究得到了6株毒株N基因序列，不僅進一步豐富中國PRRSV序列數據庫，而且可以通過與其他分離株進行比較來發現病毒的變異機制，找出與毒力相關的基因特征，從而為閔行地區PRRS的診斷和防制提供理論依據[10，11]。

參考文獻：

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