路路通酸對乳腺癌MCF-7細胞和宮頸癌C-33A細胞增殖的影響

穆曉婷，錢 平，蔣璐璐，王 玥，靳 鑫，張東方

路路通酸對乳腺癌MCF-7細胞和宮頸癌C-33A細胞增殖的影響

穆曉婷，錢 平，蔣璐璐，王 玥，靳 鑫，張東方*

目的 研究路路通酸(BTA)對乳腺癌MCF-7細胞及宮頸癌C-33A細胞增殖的影響。方法 采用MTT法檢測不同濃度BTA作用不同時間后對MCF-7細胞、C-33A細胞的增殖抑制作用；流式細胞儀檢測BTA處理后細胞周期的變化。結果 BTA作用于乳腺癌MCF-7細胞24、48、72 h后的IC50分別為(37.62±1.72)、(27.32±0.99)、(19.19±0.90)μmol/L。BTA作用于宮頸癌C-33A細胞24、48、72 h后的IC50分別為(34.55±0.88)、(27.20±1.03)、(16.74±0.79)μmol/L，BTA對2種細胞增殖有明顯抑制作用，且呈濃度時間依賴性(P<0.05)，流式結果顯示，BTA將MCF-7細胞阻滯在S期，并誘導其凋亡；BTA將C-33A細胞阻滯在G1-S期。結論 BTA對乳腺癌MCF-7細胞和宮頸癌C-33A細胞具有較強的增殖抑制作用，其機制與細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡有關。

路路通酸；乳腺癌；宮頸癌；增殖抑制

0 引言

路路通為金縷梅科植物楓香樹(LiquidambarformosanaHance)的干燥成熟果實，是臨床常用中藥，具有祛風活絡、利水、通經的功效，用于治療關節痹痛、麻木拘攣、水腫脹滿、乳少經閉等證[1]。現代臨床研究表明，路路通用于治療乳腺炎、卵巢囊腫、痛經、閉經等疾病療效顯著[2-3]。但是否可用于乳腺癌、宮頸癌的治療尚未見明確報道。路路通酸(Betulonic acid,BTA)，又稱樺木酮酸，為路路通的主要有效成分[4]，近年來研究發現，BTA具有良好的抗腫瘤活性，對卵巢癌、前列腺癌,人肝癌HepG-2細胞、人胃癌SGC-7901細胞和抗動物移植性S180、H22荷瘤細胞等的增殖有明顯抑制作用[5-8]，對乳腺癌和宮頸癌的研究報道較少。本實驗就BTA對乳腺癌MCF-7細胞及宮頸癌C-33A細胞增殖的影響及機制進行研究，為進一步臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 路路通酸(BTA)(純度≥98%)，由中國醫科大學藥學院中藥與生藥學教研室提供；人乳腺癌(MCF-7)細胞、人宮頸癌(C-33A)細胞由中國醫科大學細胞生物學教研室提供。BTA溶解于二甲基亞砜(DMSO)后配制成10 mmol/L儲備液于-20 ℃保存備用。

CO2細胞培養箱(MODEL 3111，美國Thermo)；垂直層流潔凈工作臺(HCB-1300V，中國海爾)；酶標儀(14495，日本BIO-RAD)；流式細胞分選儀(FACSCAN，美國BD)；DMEM細胞培養基(AAJ307791，美國GE)；RPMI-1640細胞培養基(AAK308935，美國GE)；胰酶(03050-1A，以色列Bioind)；胎牛血清(TBD31HB，天津灝洋)；溴化四氮唑藍(MTT)(JT343-250MG，美國Genview)；二甲基亞砜(DMSO)(MB-D4253，杭州柯氏)；PI染液(CF0031，北京鼎國)；其余有機試劑為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人乳腺癌MCF-7細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基，人宮頸癌C-33A細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養基，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養箱內培養傳代。

1.2.2 MTT法檢測BTA對細胞生長活性的影響 取培養至對數生長期的MCF-7細胞和C-33A細胞接種于96孔板內，每孔4 000～5 000個細胞，培養12 h使細胞貼壁。向每孔內加入用對應培養基稀釋后的BTA儲備液，使終濃度分別為2、4、6、8、10、15、20、25、30、40 μmol/L，每個濃度設5個平行孔。同時設陰性對照孔(含DMSO的培養基溶液)和空白對照孔(只含培養基溶液)。共同培養24、48和72 h后，分別于每孔加入MTT溶液10 μL，繼續培養4 h后，吸凈上清液并棄掉，每孔加入DMSO 200 μL，37 ℃培養20 min后震蕩使結晶完全溶解。酶標儀檢測490 nm波長處各孔的光密度值(OD值)，繪制生長曲線，并按以下公式計算細胞生長抑制率(Inhibition rate,IR)：IR=(陰性對照組OD值-加藥組OD值)/陰性對照組OD值×100%。以IR值對藥物濃度的對數值進行Sigmoidal擬合，計算半數抑制濃度(IC50)值，實驗重復進行3次。

1.2.3 流式細胞儀檢測BTA對細胞周期的影響 取對數生長期MCF-7細胞和C-33A細胞接種于6孔板內，37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養12 h使細胞貼壁。加入BTA溶液，使藥物終濃度達到40 μmol/L，每組設3個對照孔。培養24 h后胰酶消化細胞并收集，加入PBS混勻，1 000 r/min離心5 min后棄去上清，重復2遍后移入1.5 mL離心管，注入0.8 mL預冷的70%乙醇溶液，4 ℃過夜固定細胞。PBS沖洗細胞2次除凈乙醇，將細胞重懸于1 mL PI染液，37 ℃避光孵育30 min染色后，上機檢測細胞周期，實驗重復3次。

1.3 統計學分析 采用SPSS 17.0統計學軟件，三次獨立實驗組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用雙樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BTA對2種細胞增殖的影響 MTT法檢測結果顯示，BTA作用MCF-7細胞24、48、72 h的IC50分別為(37.62±1.72)、(27.32±0.99)、(19.19±0.90)μmol/L。BTA作用C-33A細胞24、48、72 h的IC50分別為(34.55±0.88)、(27.20±1.03)、(16.74±0.79)μmol/L，隨著BTA濃度的增加和作用時間的延長，腫瘤細胞受到的抑制作用逐漸增強，差異有統計學意義(P<0.01)，結果見圖1、圖2。

圖1 BTA對MCF-7細胞的增殖抑制率曲線

圖2 BTA對C-33A細胞的增殖抑制率曲線

2.2 流式細胞儀檢測BTA對2種腫瘤細胞周期的影響 從圖3可見，實驗組與對照組G1期細胞分布分別為(44.17%±1.32%) vs.(54.75%±3.23%)；S期分別為(45.32%±3.56%) vs.(31.46%±3.78%)；G2期分別為(10.5%±2.87%) vs.(13.79%±2.37%)；用BTA處理MCF-7細胞后，G1期的細胞比例減少，S期細胞比例增加，細胞阻滯在S期，并且在G0/G1峰前出現凋亡峰。相同濃度下，BTA對C-33A細胞周期抑制情況與MCF-7細胞不同，由圖4可見，實驗組與對照組G1期細胞分布分別為(83.74%±1.49%) vs.(79.53%±2.18%)；S期分別為(6.55%±0.57%) vs.(12.8%±1.65%)；G2期分別為(9.71%±1.19%) vs.(8.33%±0.89%)，與對照組相比，G1期細胞比例增加，S期細胞比例減少，G1-S期進程受阻，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 流式檢測BTA作用MCF-7細胞24 h后細胞周期的變化

圖4 流式檢測BTA作用C-33A細胞24 h后細胞周期的變化

3 討論

乳腺癌和宮頸癌是常見的惡性腫瘤，位居全球女性發病和死亡的前2位，治療多以手術和放化療為主，對患者不良反應較大[9]。近年來，隨著對中醫中藥抗腫瘤治療的深入研究，對腫瘤細胞有抑制作用的中藥成分逐漸受到人們的重視[10]。BTA是從中藥路路通中分離得到的天然產物，文獻報道BTA對人鼻咽癌HONE-1細胞、人口腔表皮樣癌細胞KB、人結腸癌HT29細胞有細胞毒作用[11]。體內外研究發現，BTA能抑制人肝癌HepG-2細胞和人胃癌SGC-7901細胞的生長，并可促進小鼠肝癌H22細胞凋亡[12]。本研究結果表明，BTA對MCF-7細胞及C-33A細胞的增殖均有較強的抑制作用，并能誘導MCF-7細胞凋亡。

細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下自動結束生命的過程，受內在遺傳機制調控，主要通過外源性途徑、內源性途徑和內質網應激觸發[13-14]。研究發現，BTA可以誘導多種腫瘤細胞凋亡，Yang等[10]報道，BTA對胃癌MGC-803細胞和前列腺癌PC3細胞有顯著的細胞毒活性。進一步研究發現，BTA通過激活p53蛋白，上調Bax，Caspase-3、Caspase-9蛋白的活性，觸發線粒體凋亡通路引起MGC-803細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞增殖。張秀娟等[11]通過對H22荷瘤小鼠的研究發現，BTA可能通過上調p53蛋白的表達誘導H22細胞凋亡，并能阻斷G2期、S期細胞向M期的進程，其機制可能與通過抑制PI3K/Akt存活通路有關。細胞周期調控機制的破壞與腫瘤的發生、發展密切相關，本研究結果顯示，BTA可引起MCF-7細胞凋亡，使其S期阻滯，與文獻報道BTA對H22細胞作用結果一致，推測BTA可激活凋亡蛋白，使細胞停滯在有絲分裂開始之前，從而產生增殖抑制作用；而BTA作用于C-33A細胞后，將其阻滯于G1-S期，使其DNA復制過程受阻，BTA作用于不同細胞系所引起的相關基因或周期蛋白表達的不同，表現在細胞周期被阻滯在不同的階段，以及是否有凋亡的發生[15]。目前，BTA的抗腫瘤機制研究尚不全面，其對不同成因和發病部位的腫瘤細胞作用靶點不同，由此帶來的影響和內在機制有待進一步研究。

綜上所述，BTA可以抑制MCF-7細胞以及C-33A細胞增殖，其機制與誘導細胞凋亡、影響細胞周期有關，具體機制還需深入研究，以期為BTA應用于臨床治療提供依據。

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Effect of betulonic acid on proliferation of human breast cancer MCF-7 cells and human cervical cancer C-33A cells

MU Xiao-ting,QIAN Ping,JIANG Lu-lu,WANG Yue,JIN Xin,ZHANG Dong-fang*

(Department of Pharmacognosy,School of Pharmacy,China Medical University,Shenyang 110122,China)

Objective To study the effect of betulonic acid on proliferation of human breast cancer MCF-7 cells and human cervical cancer C-33A cells.Methods MTT assay was used to observe the effect of BTA on growth of cell MCF-7 and cell C-33A in various concentrations for different time periods.Cell cycle and cell apoptosis of these cells were assessed by flow cytometry.Results MTT results showed that the IC50on MCF-7 cells were (37.62±1.72),(27.32±0.99) and (19.19±0.90) μmol/L after being cultured for 24 h,48 h,and 72 h,while on C-33A cells they were (34.55±0.88)，(27.20±1.03) and (16.74±0.79)μmol/L.BTA could significantly inhibit the proliferation of MCF-7 cells and C-33A cells in a dosage-and time-dependent manner (P<0.05).Flow cytometry analysis showed that BTA could induce MCF-7 cells arrest at S phase,and induce apoptosis,while it induced MCF-7 cells arrest at G1-S phase.Conclusion BTA can inhibit the proliferation of MCF-7 cells and C-33A cells;the change of cell cycle and apoptosis may be involved in the process of inhibition.

Betulonic acid;Breast cancer;Cervical cancer;Proliferation inhibition

2016-09-19

中國醫科大學藥學院中藥與生藥學教研室，沈陽 110122

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201703004