小建中膠囊對幽門螺桿菌體外抑菌作用的研究

劉東升，王友華，王 犇，趙巧云，朱振華，謝 勇

小建中膠囊對幽門螺桿菌體外抑菌作用的研究

劉東升1,2，王友華1,2，王 犇1,2，趙巧云1,2，朱振華1,2，謝 勇1,2*

目的 探討小建中膠囊浸膏液在體外對幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是否存在抑菌作用及其最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。方法 國際標準菌株NCTC11637和臨床分離的4例多藥耐藥菌株及3例敏感菌株作為實驗菌株。采用打孔法測定小建中膠囊對幽門螺桿菌體外是否有抑菌作用，并用瓊脂稀釋法測定小建中膠囊浸膏液對Hp菌株的MIC值。結果 小建中膠囊對Hp標準菌株和臨床分離的敏感及耐藥菌株體外均有抑菌作用，其MIC值為0.78～1.56 mg/mL，且對抗生素耐藥和敏感菌株之間無差別。結論 小建中膠囊在體外對Hp有抑菌作用，有望用于Hp相關性疾病的治療。

幽門螺桿菌；小建中膠囊；體外抑菌試驗

0 引言

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)，是一種定植于人體胃黏膜組織中的螺旋形桿菌，我國人群Hp感染率總體較高，Hp感染是導致消化性潰瘍、慢性胃炎和胃癌等疾病的重要誘因。近年來，臨床發(fā)現(xiàn)，在三聯(lián)基礎上聯(lián)合中藥治療Hp感染，可以提高其根除率[1]，但是中藥對于耐藥菌株是否有抑菌作用鮮有報道。筆者采用打孔法和瓊脂稀釋法進行小建中膠囊對幽門螺桿菌體外抑菌試驗，探討小建中膠囊對Hp的體外抑菌作用和最低抑菌濃度?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 來自南昌大學第一附屬醫(yī)院消化研究所保存的國際標準菌株NCTC11637(菌株1)，及從該所保存的2015年1-6月期間已行濃度梯度法(E-test)藥物敏感檢測的Hp臨床分離株中，篩選出對阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素、莫西沙星、利福平以及阿奇霉素8種抗生素中3種或3種以上耐藥的多藥耐藥菌4株(菌株2、菌株3、菌株4、菌株5)和全敏感菌株3株(菌株6、菌株7、菌株8)。

1.1.2 實驗用藥和主要試劑 小建中膠囊浸膏液(朗致集團貴州太和制藥有限公司提供，純化水作為溶媒，100 mL浸膏液中含有50 g藥粉)、Karmali瓊脂(英國OXOID公司)、Muller-Hinton瓊脂(英國OXOID公司)、無菌脫纖維綿羊血(蘭伯瑞生物技術有限公司)、E-test試紙條(法國生物梅里埃公司)。

1.1.3 實驗設備 MCO-175M型三氣培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)、生物安全柜(新加坡ESCO公司)、-80 ℃冰箱(日本Sanyo公司)。

1.2 方法

1.2.1 再次驗證上述8株Hp的最小抑菌濃度(MIC) 取出在-80 ℃冰箱內保存的Hp菌株，解凍后取200 μL，用接種環(huán)均勻涂抹于Karmali瓊脂培養(yǎng)基上，放置三氣培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，設置微需氧條件：溫度37 ℃、O25%、CO210%、N285%，培養(yǎng)2～3 d。通過觀察菌落形態(tài)，革蘭染色，過氧化物、尿素酶及氧化酶試驗，進行菌株鑒定。鑒定依據(jù)主要包括：菌落特征為無色透明、針尖樣細小或融合成片，表面光滑濕潤。革蘭染色陰性，光鏡下呈S形、弧形、海鷗狀彎曲或短桿狀。生化反應結果為尿素酶試驗陽性、觸酶試驗陽性和氧化酶試驗陽性。

經鑒定確定為Hp的菌株，調整濃度至108cfu/mL的菌懸液均勻涂抹于5%綿羊全血Muller-Hinton瓊脂平板上，同時接種標準菌株NCTC11637作為質控。待水份吸收后，貼E-test試紙條，倒置平放于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48～72 h后觀察結果，獲得多藥耐藥菌株和全敏感菌株。耐藥的判定根據(jù)美國臨床實驗室標準委員會(NCCLS)的藥敏試驗標準判讀細菌為耐藥或敏感：MIC≥1 μg/mL定為阿莫西林耐藥，MIC≥8 μg/mL定為甲硝唑耐藥，MIC≥1 μg/mL定為左氧氟沙星耐藥，MIC≥1 μg/mL定為克拉霉素耐藥，MIC>2 μg/mL定為四環(huán)素耐藥，呋喃唑酮抑菌圈直徑≤7 mm定為耐藥。質控菌株Hp NCTC11637質控范圍見表1。

表1 質控菌株NCTC11637的質控范圍

注：AC:阿莫西林，MZ:甲硝唑,CH:克拉霉素，LE:左氧氟沙星,TC:四環(huán)素

1.2.2 小建中膠囊浸膏液對Hp藥物敏感實驗 選取標準菌株NCTC11637(菌株1)和分離的多藥耐藥臨床菌株(菌株2、菌株3、菌株4、菌株5)及全敏感菌株(菌株6、菌株7、菌株8)，將菌株進行傳代3～4次，擴大培養(yǎng)至實驗所需，接種于含5%綿羊全血Muller-Hinton瓊脂平板上，打孔，分別加入小建中膠囊浸膏液。瓊脂稀釋法分別在制作平皿的過程中將相應的小建中膠囊浸膏液進行10、20、40、80、160、320、640倍的稀釋。第3、7天后觀察藥敏實驗結果。打孔法測量抑菌圈直徑，瓊脂稀釋法觀察在平皿上有無菌落的生長。

2 結果

2.1 E-test法實驗結果 見表2。

2.2 打孔法 見表3。

2.3 瓊脂稀釋法 見表4。

表2 所選菌株的MIC結果

注：MX:莫西沙星,RI:利福平,AZ:阿奇霉素

表3 小建中膠囊對Hp標準菌株和臨床耐藥菌株的抑菌效果

表4 小建中膠囊對Hp的體外最低抑菌濃度(mg/mL)

3 討論

Hp感染是導致消化性潰瘍、慢性胃炎的主要病因，根除Hp對于潰瘍的愈合和治療慢性胃炎、降低胃癌的發(fā)生率具有重要意義[2-5]。目前，臨床上常用四聯(lián)療法作為臨床根除Hp的首選方案[6]，但隨著抗生素的廣泛使用，Hp對抗生素的耐藥問題日益嚴重，而鉍劑長期使用有便秘、神經毒性和腎毒性等不良反應。中藥中許多治療慢性胃十二指腸疾病的方劑具有抗炎、抗菌作用，并被證實可殺滅Hp。

Hp屬于中醫(yī)的“邪氣”范疇。中醫(yī)理論認為，“邪之所湊,其氣必虛”。脾胃虛弱是Hp感染的病理基礎。小建中膠囊源自張仲景《傷寒論》中的小建中湯，由桂枝、白芍、炙甘草、生姜、大棗組成，是國家批準的用于治療胃及十二指腸潰瘍的現(xiàn)代中成藥。方中桂枝溫陽祛寒，白芍養(yǎng)陰止痛,生姜溫胃散寒,大棗補脾益氣,炙甘草益氣合中?，F(xiàn)代藥理學研究表明，桂枝、白芍、甘草、生姜均具有抗菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜的作用[7-11]；白芍、甘草還可以抑制胃酸分泌、保護胃黏膜，抗?jié)僛9,11]；大棗可以增強免疫[12]，諸藥合用，共奏溫中補虛、緩急止痛之功效，對Hp感染的胃黏膜損傷具有治療作用[13]。

本研究結果表明，小建中膠囊對Hp臨床耐藥菌株具有體外抑菌作用，小建中膠囊對Hp體外具有抑菌作用，其最低抑菌濃度為1.56 g/L，小建中膠囊的常用劑量為3.6 g/d，其口服后，在胃內濃度將高于其對Hp的最低抑菌濃度1.56 g/L，因此，其作為抗Hp治療的輔助藥物，有望提高Hp的根除率。臨床上常用小建中膠囊治療胃炎和消化性潰瘍[14-15]，或可提高其對Hp感染患者的依從性和治愈率。但在抗Hp感染作用機制上尚需進一步探討。

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Invitroactivity of Xiaojianzhong capsules against clinical isolates ofHelicobacterpylori

LIU Dong-sheng1,2,WANG You-hua1,2,WANG Ben1,2,ZHAO Qiao-yun1,2,ZHU Zhen-hua1,2,XIE Yong1,2*

(1.Digestive Department,First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China;2.Jiangxi Institute of Gastroenterology & Hepatology,Nanchang 330006,China)

Objective To evaluate the activity of xiaojianzhong capsules against clinical isolates of antibiotic-resistant and antibiotic-sensitiveHelicobacterpylori(Hp).Methods In thisinvitrostudy,Xiaojianzhong capsule was investigated for bacteriostic activity using agar dilution or E-test methods.Four antibiotic-resistant strains and 3 antibiotic-sensitive strains and 11 637 standard strains were examined.Results Xiaojianzhong was active against Hp standard strains and clinical isolates of antibiotic-resistant and antibiotic-sensetive Hp.To xiaojianzhong capsules,the MIC ranged from 0.78 mg/mL to 1.56 mg/mL.Conclusion Xiaojianzhong capsules have inhibitory activity on antibiotic-sensitive and antibiotic-resistant Hp strainsinvitro.

Helicobacterpylori；Xiaojianzhong capsules；Invitroexperiment

2016-08-30

1.南昌大學第一附屬醫(yī)院消化科，南昌330006;2.江西省消化疾病研究所,南昌330006

江西省科技支撐計劃項目(2009BSB11214)；江西省教育廳項目(GJJ10327)

10.14053/j.cnki.ppcr.201703006

*通信作者