大片段PCR方法檢測CYP2D6*5基因分型的選擇與優(yōu)化

柴 琳，劉 紅，許 莉，李一石

·藥學(xué)研究·

大片段PCR方法檢測CYP2D6*5基因分型的選擇與優(yōu)化

柴 琳，劉 紅*，許 莉，李一石

目的 經(jīng)過比較選擇更優(yōu)化的大片段PCR方法，應(yīng)用到臨床研究中對CYP2D6*5基因分型檢測。方法 選擇兩種大片段PCR方法(傳統(tǒng)和巢式大片段PCR)進行比較優(yōu)化，并對329例健康男性人群進行CYP2D6*5基因分型的檢測。結(jié)果 本研究中傳統(tǒng)大片段PCR方法分型檢測率為92.6%，巢式大片段PCR方法分型檢測率為100%；在研究群體中CYP2D6*5等位基因的發(fā)生頻率為3.9%(n=26)。結(jié)論 優(yōu)化的大片段PCR方法使CYP2D6*5基因分型更高效明確，且巢式大片段PCR方法優(yōu)于傳統(tǒng)大片段PCR方法。

CYP2D6*5;大片段PCR;巢式大片段PCR;基因分型

0 引言

藥物代謝酶參與了多種藥物在人體內(nèi)的代謝[1]，其具有3種表型：弱代謝型(PM)、中間代謝型(IM)和快代謝型(RM)[2]。目前已知藥物代謝酶的3種表型與其基因多態(tài)性有關(guān)。其中，弱代謝者會引起更多臨床關(guān)注，因其在藥物正常劑量下會產(chǎn)生過度或持續(xù)的治療作用(或者藥物相關(guān)毒性)，即基因傾向的藥物不良影響。除此之外，對于需要被藥物代謝酶活化的化合物，弱代謝者的藥物反應(yīng)會被削弱，即弱代謝者很可能在標準劑量下無法達到理想的治療效果。

細胞色素P450 2D6(CYP2D6)介導(dǎo)多種藥物(如抗抑郁藥物、阿片類藥物、抗精神病藥物和β-腎上腺素受體阻滯劑等)的氧化代謝[3]。CYP2D6的基因具有高度多態(tài)性，已有100多個等位基因變異[4]，這些基因多態(tài)性可能引起個體或種族間CYP2D6的體內(nèi)活性差異。對于CYP2D6弱代謝者，在高加索人中約占5%～10%[5]；然而在中國、日本等亞洲人群中僅占1%～2%左右[6]。導(dǎo)致其弱代謝的等位基因變異有CYP2D6*3(移碼突變)、CYP2D6*4(堿基置換突變)和CYP2D6*5(缺失突變)，其中CYP2D6*5導(dǎo)致藥物代謝酶失活。CYP2D6*5是一種CYP2D6全基因缺失的突變體，在高加索人中的出現(xiàn)頻率為2%～7%[3]，在中國人中為3%～7%[7-8]。

目前，CYP2D6*5基因分型通常采用DNA印跡雜交或Taqman探針等方法，通常比較復(fù)雜、昂貴、耗時；大片段PCR法可將整個基因缺失擴增出來，相對低廉，操作性強，辨識度高。由于長模板擴增自身的困難性，CYP2D6*5檢測的相關(guān)文獻報道很少。本研究對比了2種針對CYP2D6*5基因分型檢測的大片段PCR方法，即傳統(tǒng)大片段PCR方法[9]和巢式大片段PCR法[10]，旨在選擇更優(yōu)化的大片段PCR方法，應(yīng)用于臨床研究中對CYP2D6*5基因分型檢測中。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血樣標本 選擇329例健康男性志愿者，所有標本都來自中國漢族人群。倫理委員會批準該項研究進行，并獲得了所有參與受試者的知情同意。

1.1.2 主要試劑和儀器 LA Taq試劑盒(寶生物工程有限公司)，λDNA HindⅢ、1 kb DNA Ladder(天根生化科技有限公司)，普通PCR儀(美國ABI 9700)，瓊脂糖水平電泳儀(北京市六一儀器廠)，全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能Tanon 2500)，常規(guī)耗材均為Axygen公司。

1.1.3 引物 CYP2D6*5基因分型檢測引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。引物序列見表1。

表1 CYP2D6*5基因分型試驗引物列表

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用血液基因組DNA提取試劑盒(天根)按照說明提取全血DNA。

1.2.2 傳統(tǒng)大片段PCR方法 利用大片段PCR法進行CYP2D6*5基因分型試驗。大片段PCR反應(yīng)在20 μL總體積中進行，包括0.1 μmol/L引物CYP2D6*5-F1和CYP2D6*5-R2，1 μmol/L引物CYP2D6*5-F3，0.3 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2，LA PCR緩沖液，1 U LA Taq酶與1.6 μL基因組DNA。反應(yīng)條件參數(shù)：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性20 s，70 ℃延伸6 min，進行30個循環(huán)；然后70 ℃繼續(xù)延伸6 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR擴增產(chǎn)物在0.7%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.2.3 優(yōu)化的傳統(tǒng)大片段PCR方法 對傳統(tǒng)大片段PCR方法進行優(yōu)化：擴大PCR反應(yīng)體系至50 μL，兩對引物分別在獨立的PCR體系中進行擴增。優(yōu)化的大片段PCR反應(yīng)在50 μL總體積中進行，包括0.2 μmol/L引物CYP2D6*5-F1和CYP2D6*5-R2(另一體系為0.2 μmol/L引物CYP2D6*5-F3和CYP2D6*5-R2)，0.3 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2，LA PCR緩沖液，2 U LA Taq酶與1.6 μL基因組DNA。反應(yīng)條件參數(shù)同前。

1.2.4 巢式大片段PCR方法 利用巢式大片段PCR的方法進行CYP2D6*5基因分型試驗。巢式大片段PCR的第1次PCR反應(yīng)在50 μL總體積中進行，包括0.3 μmol/L引物CYP2D6*5-i和CYP2D6*5-ii，0.15 μmol/L引物CYP2D6*5-iii和CYP2D6*5-iv，0.4 mmol/L dNTPs，10×含Mg2+LA PCR緩沖液，1 U LA Taq酶與150 ng基因組DNA。反應(yīng)條件參數(shù)見表2。

表2 巢式大片段PCR反應(yīng)條件

反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。第1次PCR的擴增產(chǎn)物50倍稀釋后作為巢式大片段PCR的第2次PCR反應(yīng)模板。第2次PCR反應(yīng)在50 μL總體積中進行，包括0.3 μmol/L引物CYP2D6*5-v和CYP2D6*5-vi，0.15 μmol/L引物CYP2D6*5-iii和CYP2D6*5-vii，1.0 mmol/L dNTPs，10×含Mg2+LA PCR緩沖液，2.5 U LA Taq酶與1 μL擴增產(chǎn)物稀釋液。反應(yīng)條件同前。反應(yīng)結(jié)束后取2 μL PCR擴增產(chǎn)物10倍稀釋液在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.2.5 優(yōu)化的巢式大片段PCR方法 對巢式大片段PCR方法進行優(yōu)化：增加dNTPs濃度到1.0 mmol/L，增加LA Taq酶到2.5 U。同時對反應(yīng)條件進行優(yōu)化，具體參數(shù)見表3。

表3 優(yōu)化后巢式大片段PCR反應(yīng)條件

2 結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)大片段PCR及優(yōu)化 圖1為傳統(tǒng)大片段PCR方法，引物F1、R2擴增出3.5 kb條帶，為CYP2D6*5檢測的特異性片段；引物F3、R2擴增出4.7 kb條帶，為CYP2D6基因特異性片段。優(yōu)化后的獨立反應(yīng)體系與混合反應(yīng)體系相比較，擴增條帶更清晰，分型更明確。

圖1 傳統(tǒng)大片段PCR及優(yōu)化CYP2D6*5基因分型預(yù)試驗

圖1為傳統(tǒng)大片段PCR方法及優(yōu)化，Marker為λDNA HindⅢ Ladder，C為空白對照，a、b、c為樣品。其中4.7 kb是CYP2D6基因檢測的特異性片段，3.5 kb是CYP2D6*5檢測的特異性片段。樣品a、b檢測到2個片段，表明其為CYP2D6*5雜合體，而樣品c僅檢測到CYP2D6基因特異性片段，未檢測到CYP2D6*5。

2.2 巢式大片段PCR及優(yōu)化 圖2為巢式大片段PCR方法，第1次PCR反應(yīng)中引物i、ii、iii、iv擴增出5.1 kb和3.2 kb 2個條帶，其中3.2 kb為CYP2D6*5檢測的特異性片段，5.1 kb為CYP2D6基因特異性片段；第2次PCR反應(yīng)中引物iii、v、vi、vii擴增出4.1 kb和3.1 kb 2個條帶，其中3.1 kb為CYP2D6*5檢測的特異性片段，4.1 kb為CYP2D6基因特異性片段。優(yōu)化后的PCR反應(yīng)不僅大大縮短了反應(yīng)時間，而且提高了擴增效率，使擴增條帶更清晰；巢式大片段PCR方法增加了CYP2D6*5基因分型試驗的擴增特異性和分型靈敏度。

圖2A為巢式大片段PCR方法，圖2B為優(yōu)化的巢式大片段PCR方法，Marker為1 kb DNA Ladder，C為空白對照，b、c為樣品。第1次PCR反應(yīng)中5.1 kb是CYP2D6基因檢測的特異性片段，而3.2 kb是CYP2D6*5檢測的特異性片段；第2次PCR反應(yīng)中4.1 kb是CYP2D6基因檢測的特異性片段，而3.1 kb是CYP2D6*5檢測的特異性片段。樣品b檢測到2個片段，表明其為CYP2D6*5雜合體，而樣品c僅檢測到CYP2D6基因特異性片段，未檢測到CYP2D6*5。

圖2 巢式大片段PCR及優(yōu)化CYP2D6*5基因分型預(yù)試驗

2.3 優(yōu)化的CYP2D6*5基因分型試驗 采用優(yōu)化的大片段PCR方法進行CYP2D6*5基因分型試驗(見圖3、圖4)，兩種方法分型結(jié)果一致。對于優(yōu)化的傳統(tǒng)大片段PCR方法，如果加入的DNA模板量不足或者PCR失敗，擴增條帶不清晰，很容易導(dǎo)致CYP2D6*5分型誤判，分型檢測率為92.69%。相較而言，優(yōu)化的巢式大片段PCR方法反應(yīng)穩(wěn)定高效，擴增條帶清晰，分型明確，分型檢測率為100%。

圖3 優(yōu)化的傳統(tǒng)大片段PCR CYP2D6*5基因分型試驗

圖3A為優(yōu)化的傳統(tǒng)大片段PCR中F3/R2體系，圖3B為優(yōu)化的傳統(tǒng)大片段PCR中F1/R2體系，Marker為λDNA HindⅢLadder，C為空白對照，1～9為樣品。其中4.7 kb是CYP2D6基因檢測的特異性片段，而3.5 kb是CYP2D6*5檢測的特異性片段。樣品2、9檢測到2個片段，表明其為CYP2D6*5雜合體，而樣品1、3、4、5、6、7、8僅檢測到CYP2D6基因特異性片段，未檢測到CYP2D6*5。

圖4 優(yōu)化的巢式大片段PCR CYP2D6*5基因分型試驗

圖4A為第1次PCR反應(yīng)，其中5.1 kb是CYP2D6基因檢測的特異性片段，而3.2 kb是同一PCR反應(yīng)中CYP2D6*5檢測的特異性片段；圖4B為第2次PCR反應(yīng)，4.1 kb是CYP2D6基因檢測的特異性片段，而3.1 kb是同一PCR反應(yīng)中CYP2D6*5檢測的特異性片段。Marker為1kb DNA Ladder，C為空白對照，1～9為樣品。樣品2、9檢測到2個片段，表明其為CYP2D6*5雜合體，而樣品1、3、4、5、6、7、8僅檢測到CYP2D6基因特異性片段，未檢測到CYP2D6*5。

2.4 CYP2D6*5基因分型結(jié)果 巢式大片段PCR CYP2D6*5基因分型試驗結(jié)果分析表明，329個樣本中有26個樣本擴增出2個特異性片段，即CYP2D6*5雜合體。CYP2D6*5在本研究試驗群體中的出現(xiàn)頻率為3.7%，同相關(guān)研究比較略低[7,10]。見表4。

表4 CYP2D6*5基因頻率結(jié)果

3 討論

CYP2D6位于22號染色體長臂(33q13.1)上，負責(zé)CYP2D6蛋白的調(diào)控，參與了很多藥物的代謝。CYP2D6基因分型的一大難點是CYP2D6與上游的假基因CYP2D8P和同源基因CYP2D7連接緊密。本研究專注于正確地識別CYP2D6基因缺失，這種缺失會影響許多重要臨床藥物的代謝。為了在藥物臨床試驗前確定相關(guān)的基因信息，需要確定一種簡單穩(wěn)定的CYP2D6基因分型試驗體系，以便于快速識別出志愿者中CYP2D6野生型和基因缺失型。由于CYP2D6*5是CYP2D6全基因缺失，需要利用大片段PCR將其從整個基因中擴增出來。正因為長模板擴增的困難性，CYP2D6*5檢測的相關(guān)文獻報道很少。本研究優(yōu)化了2種CYP2D6*5基因分型試驗中大片段PCR方法，提高了擴增的效率和CYP2D6*5分型的準確度。同傳統(tǒng)大片段PCR方法相比，巢式大片段PCR通過引物的設(shè)計，有效地縮短了擴增產(chǎn)物長度(野生型擴增產(chǎn)物縮短了1 kb，缺失型縮短了300 bp)，對于CYP2D6*5基因分型可信度更高。第1次PCR后，基本可以判定CYP2D6*5的基因分型，嵌套在第1次PCR產(chǎn)物中的第2次PCR，減少了誤判并增加了分型靈敏度。

總之，本研究優(yōu)化的兩種大片段PCR方法快速可靠，成本低且不需要特殊的試劑和儀器。此外，本研究確定了一種穩(wěn)定的CYP2D6* 5快速分型方法，即優(yōu)化的巢式大片段PCR。其可作為一個內(nèi)部標準應(yīng)用到CYP2D6基因缺失影響的藥物臨床研究中。同時，CYP2D6基因絕大多數(shù)突變?yōu)镾NP，用Taqman探針和PCR-RFLP方法即可檢測(CYP2D6*5除外)，本研究CYP2D6*5的分型檢測方法可作為SNP檢測分析的補充，對群體進行CYP2D6基因檢測分析。

[1] Sim SC,Ingelman-Sundberg M.The Human Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature website:a peer-reviewed database of CYP variants and their associated effects[J].Hum Genomics,2010,4(4):278-281.

[2] Gervasini G,Benítez J,Carrillo JA.Pharmacogenetic testing and therapeutic drug monitoring are complementary tools for optimal individualization of drug therapy[J].Eur J Clin Pharmacol,2010,66(8):755-774.

[3] Ingelman-Sundberg M.Genetic polymorphisms of cytochrome P450 2D6 (CYP2D6):clinical consequences,evolutionary aspects and functional diversity[J].Pharmacogenomics J,2005,5(1):6-13.

[4] Sim SC.CYP2D6 allele nomenclature[EB/OL]:http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm,2016-1-19.

[5] Ozawa S,Soyama A,Saeki M,et al.Ethnic differences in genetic polymorphisms of CYP2D6,CYP2C19,CYP3As and MDR1/ABCB1[J].Drug Metab Pharmacokinet,2004,19(2):83-95.

[6] Bertilsson L,Dahl ML,Dalén P,et al.Molecular genetics of CYP2D6:clinical relevance with focus on psychotropic drugs[J].Br J Clin Pharmacol,2002,53(2):111-122.

[7] Ji L,Pan S,Marti-Jaun J,et al.Single-step assays to analyze CYP2D6 gene polymorphisms in Asians:allele frequencies and a novel *14B allele in mainland Chinese[J].Clin Chem,2002,48(7):983-988.

[8] Garcia-Barceló M,Chow LY,Chiu HF,et al.Genetic analysis of the CYP2D6 locus in a Hong Kong Chinese population[J].Clin Chem,2000,46(1):18-23.

[9] Okubo M,Murayama N,Miura J,et al.A rapid multiplex PCR assay that can reliably discriminate the cytochrome P450 2D6 whole-gene deletion allele from 2D6*10 alleles[J].Clin Chim Acta,2012,413(19-20):1675-1677.

[10]Ota T,Hayashida M,Ishii M,et al.Long PCR-based genotyping for a deleted CYP2D6 gene without DNA extraction[J].Drug Metab Pharmacokinet,2014,29(3):283-285.

[11]周仁芳,曾愛平.浙江沿海地區(qū)漢族人群CYP2D6基因拷貝數(shù)多態(tài)性研究[J].中國實驗診斷學(xué),2008,12(7):860-863.

Selection and optimization of long-PCR method for CYP2D6*5 genotyping assay

CHAI Lin,LIU Hong*,XU Li,LI Yi-shi

(Key Laboratory of Clinical Trial Research in Cardiovascular Drugs,Ministry of Health,State Key Laboratory of Cardiovascular Disease,Fuwai Hospital,National Center for Cardiovascular Diseases,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100037,China)

Objective To select a long-PCR method which is applied to the clinical research of CYP2D6*5 genotyping.Methods Two long-PCR methods were selected,compared and optimized to detect the genotyping of CYP2D6*5 in 329 Chinese male subjects.Results In our study,successful detection rate of traditional long-PCR method was 92.6%,however the rate of nested long-PCR method was 100% and CYP2D6*5 allele frequency in our study was 3.9% (n=26).Conclusion Optimization made these two long-PCR methods of CP2D6*5 more effective and accurate.Furthermore,the nested long-PCR is working better than the traditional one.

CYP2D6*5;Long-PCR;Nested long-PCR;Genotyping

2016-09-09

衛(wèi)生部心血管藥物臨床研究重點實驗室,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京 100037

2010年國家臨床重點專科建設(shè)項目——《衛(wèi)生部重點實驗室項目》;“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項——《心血管創(chuàng)新藥物臨床研究技術(shù)平臺建設(shè)》(2012ZX09303-008-001)

10.14053/j.cnki.ppcr.201703019

*通信作者