乙型肝炎病毒耐藥檢測研究進展

李軍

[摘 要] 核苷（酸）類似物（NA）是目前臨床治療乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染的首選方案，但隨著治療時間的延長，HBV耐藥性的產生極易對治療效果造成影響。HBV耐藥性檢測包括基因型耐藥和表型耐藥分析兩種手段，其中前者可明確HBV基因組中已知與耐藥相關的病毒變異，在近年來病毒耐藥性檢測領域受到了廣泛關注。本文就HBV耐藥原因以及DNA直接測序技術、焦磷酸測序技術等十余種基因型耐藥檢測方案進行綜述，旨在為強化HBV耐藥管理提供參考。

[關鍵詞] 乙型肝炎病毒；耐藥；檢測；進展

中圖分類號：R446 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2017）01-025-03

DOI：10.11876/mimt201701010

據世界衛生組織（WHO）統計，目前全球乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）慢性感染者為3.5億，其中30%患者已進展至肝硬化階段，需及時實施長期、有效的抗病毒治療[1]。干擾素和核苷（酸）類似物（NA）兩大類抗病毒藥物是目前臨床治療HBV感染的主要藥物，其中，NA以其服用方便、安全性高、抑制病毒復制作用明確等優勢，得到了廣泛應用[2]。但其缺陷在于，需長期服用方可將HBV抑制在較低水平，降低肝硬化、肝癌等繼發疾病發生風險，而長期服用NA可誘導HBV耐藥突變的發生，加之近年來低耐藥屏障NA序貫應用的逐步推廣，HBV多藥耐藥為臨床治療帶來了更為嚴峻的挑戰[3-4]。本文就HBV耐藥機制、耐藥檢測及防治策略進行綜述，旨在為HBV耐藥的監測與分析提供參考。

1 HBV耐藥原因

1.1 HBV耐藥機制

缺乏校正的逆轉錄伴隨著HBV復制的全過程，若HBV基因突變位點恰好處于HBV-DNA聚合酶的逆轉錄區域，則極有可能導致耐藥性的產生[5]。應用抗病毒藥物治療前，慢性乙肝患者體內往往并不存在耐藥株，均為野生株，但抗病毒藥物對HBV的選擇性作用，可逐漸導致藥物敏感野生株逐漸減少、耐藥株獲得生存，繼而成為優勢病種株，最終引發HBV總體耐藥性的產生[6]。

1.2 HBV耐藥因素

研究表明，藥物的空間結構、基因屏障及藥代動力學特征均在耐藥性的產生環節扮演了重要角色[7]。如拉米夫定與三磷酸脫氧胞苷（dCTP）結構差異明顯，但阿德福韋酯與dCTP十分接近，故前者更易發生HBV耐藥。Lee等[8]發現，拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定在發生耐藥變異時，HBV耐藥株僅1個位點發生突變，而恩替卡韋耐藥株需在上述突變基礎上發生3個位點聯合突變，故初治患者恩替卡韋耐藥率極低。若抗病毒藥物可同時強烈抑制野生株、耐藥株復制，則其藥代動力學優勢可保證HBV處于較低的耐藥性。除抗病毒藥物自身因素外，患者HBV-DNA定量、病程、年齡、依從性、治療方案、病情等基礎狀態亦可對HBV耐藥性造成明顯影響[9]。

1.3 HBV耐藥分類

HBV耐藥包括基因耐藥、交叉耐藥兩種類型，其中基因耐藥即為HBV基因序列發生耐藥相關基因突變，若該基因突變導致病毒株對藥物敏感性降至野生株的25%以下，則被稱為表型耐藥；交叉耐藥是指病毒在發生基因耐藥的同時，不僅對某一種藥物耐藥，且同時對另外一種無關藥物存在耐藥性。目前臨床常用抗病毒藥物的耐藥性分別為：拉米夫定20%～69%，阿德福韋酯11%～29%，恩替卡韋9%，替比福定2%～4%，隨用藥時間的延長，其耐藥性不斷增加[10]。

2 HBV耐藥檢測

2.1 DNA直接測序技術

DNA直接測序技術是最為經典的HBV耐藥檢測方法，在所有耐藥變異檢測技術中，DNA直接測序技術的準確性、特異性均處于較高水平，且多數學者均將該技術作為檢測其他技術功效的對比標準[11]。但由于該技術耗時久、經濟性差、技術落后、檢出限高達20%，且易出現混合感染中少量HBV感染的漏檢，近年來應用逐漸減少。

2.2 焦磷酸測序技術

焦磷酸測序在DNA直接測序技術的基礎上發展而來，是借助DNA合成過程中釋放的焦磷酸判斷HBV耐藥情況的新型酶級聯二代測序技術，與過往Sanger法ddNTP參與的鏈終止反應相比，該技術不需電泳、熒光標記，且分析快速、靈敏度高，可實現自動化定量分析。有學者將該技術用于HBV突變質粒標準品的檢測，發現該技術10 min即可完成接近100份樣本的檢測，且檢出限低至4%[12]。但其不足之處在于閱讀長度僅為40 bp，覆蓋范圍有限，故羅氏最新研發的454 GS FLX測序平臺在該技術的基礎上進一步優化，提供了超深度焦磷酸測序技術，將其閱讀長度延伸至250 bp，檢出限進一步升至1%，其高靈敏度、特有基因頻率分析功能得到了廣泛認可，但同時也大大增加了設備成本以及數據復雜性，臨床推廣受限[13]。

2.3 拉鏈核酸檢測技術

拉鏈核酸（ZNA）是一種寡核苷酸，可以拉鏈形式連接互補核苷酸，故被稱為“拉鏈核酸”，其可被陽離子精胺衍生物單元（Z單元）修飾，進而減少核苷酸鏈之間負電荷排斥力、提升引物和探針退火溫度，在增強雙鏈雜交穩定性及錯配識別能力方面具有重要作用[14]。由于ZNA的Tm值僅受Z單元數量、寡核苷酸鏈長度影響，其探針設計極為簡便、靈活。有學者針對HBV YMDD、YVDD、YSDD、YIDD序列設計不同的探針，發現該技術突變病毒載量檢測底線可達35 copies/mL，是其他技術檢測底線的300倍以上，且其靈敏性、特異性均較高，為野生、突變株的定量比例計算提供了可能，亦可動態監測耐藥株比例的實時變化[15]。其缺陷在于，需針對不同位點設計不同ZNA探針，雖然探針設計較為簡便，但仍為臨床工作者增加了較大的工作量負擔。

2.4 AllGlo探針實時熒光PCR技術

目前TaqMan探針、分子信標、雜交探針、雙鏈置換探針等實時PCR探針應用十分廣泛，在此基礎上，AllGlo探針不僅具有上述探針全部的優點，還具有更高的熒光強度、檢測靈敏度、特異性及廣泛的可選熒光種類，有學者將AllGlo探針同時用于四種人乳頭瘤病毒的單管檢測，取得了良好的效果[16]。Kitrinos等[17]設計HBV YMDD、YIDD、YVDD的針對性AllGlo探針，發現其檢測限達50 copies/mL，且與直接測序法比較未發現不一致結果，顯現出該技術較高的準確性。需要注意的是，AllGlo探針在保持高靈敏度的同時，對靶序列保守性的要求極高，故在突變率較高的HBV耐藥性檢測方面，適用性不夠廣泛。

2.5 量子點DNA熒光共振能量轉移傳感器技術

量子點DNA熒光共振能量轉移（QDs-DNA-FRET）技術在單核苷酸多態性、微量DNA的檢測中得到了廣泛關注，其檢測方法僅需3步，分別為連接量子點表面形成功能性QDs-DNA連接體、向連接體內加入報告探針、應用FRET及寡核苷酸連接酶檢測反應測定熒光信號。突變型HBV存在的單堿基錯配可導致QDs-DNA復合體雜交失敗，故無法參與FRET反應，亦無熒光信號產生[18]。其優勢在于無須PCR擴增、特異性佳，且具有高效性、快速性，可同時實施多位點檢測，同時，檢測設備僅需多標記分析儀，易于臨床實驗室推廣。但該技術亦需應用大量配套特殊試劑，是限制其推廣的主要原因。

2.6 PCR侵入技術

與其他PCR技術的差別在于，PCR侵入技術不是對目的核酸進行擴增，而是實施探針信號擴增，通過侵入探針、信號探針、靶核酸分子檢測和側翼核酸內切酶3個體系，該技術可迅速分開熒光基團與淬滅基團，其檢測下限為10 copies/mL，耐藥病毒株檢測比例可低至2%，且其對信號DNA進行擴增可大大降低檢測過程中造成的污染，具有較強的特異性[19]。該技術的不足之處與ZNA檢測技術類似，即需根據不同位點設計對應的侵入探針、信號探針，在一定程度上增加了檢測的煩瑣度。

2.7 限制性片段長度多態性技術

限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）技術主要借助DNA限制性內切酶特性，切割已知HBV耐藥突變并行PCR擴增，從而區分HBV耐藥突變與非HBV耐藥突變。其優勢在于操作簡便、一次性可檢測大量突變、靈敏度和特異性均較高，但其優勢也同樣明顯，即對于變異快速的HBV，無法及時制作針對性限制性內切酶，導致檢測失敗。此外，Ayres等[20]指出，若擴增產物可被限制性內切酶識別，則可能導致目標片段酶活性競爭，影響檢測結果。

2.8 基質輔助激光解吸離子飛行質譜技術

基質輔助激光解吸離子飛行質譜（MALDI-TOF-MS）技術是近年來新興的一種HBV耐藥檢測技術，其主要分析野生型HBV與變異型HBV間分子量差別，以明確耐藥基因突變，其重復性、特異性、靈敏度均較高，但檢測限僅為100 copies/mL，不及上述其他技術[21]。

2.9 其他技術

目前實驗室明確HBV耐藥株的方法多種多樣，除上述8種技術外，還存在肽核酸分析技術、基因芯片技術、連接酶檢測反應技術、線性探針雜交法、依賴轉染細胞模型的表型耐藥檢測等[22-26]，為DNA直接測序的替代提供了新的方向，但各種技術也或多或少的存在一定缺陷，如肽核酸分析技術的突變株結果難以解釋、基因芯片技術成本極高、連接酶檢測反應技術檢測限偏高、線性探針雜交法易漏檢、依賴轉染細胞模型僅可明確表型耐藥但無法了解基因型耐藥等。因此，如何綜合上述技術的優勢，盡可能尋求一種安全、經濟、可靠、簡便的檢測方案，仍是醫學工作者需要繼續努力的方向。

3 展望

HBV耐藥是乙型肝炎長期治療中的最大難題，密切檢測HBV耐藥甚至多重耐藥的發生，方為降低嚴重臨床結局發生風險、改善患者預后質量的關鍵。當前關于抗病毒藥物耐藥的技術眾多，且多數處于起步階段，適用性、推廣性均較為有限，對于各類現象、規律的認知亦不夠完善。但各類技術在近幾年已取得了飛速的發展，醫學工作者亦朝著低成本、高通量技術方向不斷努力，未來HBV耐藥檢測可著力于明確HBV耐藥演變，了解HBV耐藥發生發展關聯。同時，隨著耐藥突變的早期檢出，有望涌現出更多靶標抗病毒藥物，為抗病毒治療方案的個體優化、臨床療效的提升、患者預后的改善及HBV耐藥株的減少提供更多可能性。

參 考 文 獻

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