高溫對體外培養海馬神經元細胞的影響及細胞凋亡機制研究

徐明++張明++張興國++李俠++白金++尚磊

[摘 要] 目的：研究不同溫度對體外培養海馬神經元細胞的影響及其機制。方法：取出生1～3天的SD幼鼠海馬神經細胞體外培養，分為37℃和42℃2組，分別孵育12h和24h。利用CCK8、TUNEL分析、Western blot等技術，觀察12h和24h時海馬神經細胞存活率及凋亡細胞數，以及Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3蛋白表達。結果：與37℃組相比、42℃組海馬神經元細胞存活率下降，凋亡陽性細胞數明顯增加，并隨著時間延長凋亡陽性細胞數增多。42℃組中，神經元細胞Bcl-2表達減弱，Bax、cleaved-caspase3表達增強，上述指標與37℃組同時點比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：高溫可以誘導體外培養海馬神經元細胞凋亡， 可能通過PI3K/Akt信號傳導通路誘導神經細胞凋亡。

[關鍵詞] 高溫；細胞凋亡；Bcl-2；Bax；caspase3

中圖分類號：R741.02 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2017）01-082-03

DOI：10.11876/mimt201701033

高溫是一種常見職業病危害因素。文獻報道長期處于高溫環境可引起人記憶力及認知能力下降[1]。海馬作為大腦邊緣葉的重要組成部分，與認知功能有密切關系，是影響學習和記憶功能的重要腦區[2]。本實驗建立高溫致體外培養海馬神經元細胞凋亡模型，用免疫印跡法對海馬神經元細胞的凋亡相關基因 Bcl-2、Bax和活化的caspase3蛋白表達進行半定量觀察，探討高溫對海馬神經元細胞影響及細胞凋亡發生機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

10只SPF級健康SD乳鼠，出生1～3天，雌雄不限（山東大學動物實驗中心）。

1.2 儀器和試劑

二氧化碳培養箱、恒溫水浴加熱器、mini-PROTEAN電泳裝置、DMEM培養基，胎牛血清（購自杭州四季青公司），CCK8試劑盒（碧云天），TUNEL試劑盒（羅氏），DAB顯色試劑盒（碧云天），兔Bcl-2一抗、兔Bax一抗、兔cleaved-caspase3一抗（武漢三鷹）。

1.3 方法

1.3.1 細胞分組和處理 海馬神經細胞的原代培養采用文獻[3]方法。分為2組，每組3個樣本，于接種后 6d將盛有細胞懸液的離心管分別置于37℃、42℃恒溫水浴箱，2組分別在處理 12h、24h兩個時點測定各項指標，測定重復3次，取平均值。

1.3.2 CCK8檢測細胞存活率 在96孔板中接種細胞懸液，按上述方法分組培養后，向每孔加入10μL CCK8溶液，用酶標儀測定在450nm處的吸光度。每組設6個復孔，重復3次。

1.3.3 TUNEL檢測細胞凋亡 將細胞接種于含有蓋玻片的6孔板內，使細胞爬片。按照上述方法分組培養后，進行固定、洗滌、加反應液、孵育等處理，加入DAB顯色液，室溫孵育3min鏡下觀察。單盲法手工計數20個不同視野（200倍顯微鏡）下TUNEL陽性細胞數，取平均值，計算凋亡細胞百分率。

1.3.4 Western blot檢測Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3蛋白表達 分組處理后，將50μg變性蛋白進行10%SDS -PAGE電泳，轉膜上。室溫封閉1h，分別加相應一抗及GAPDH內參，4℃搖床孵育過夜。第2天二抗室溫孵育1h， ECL反應，經LAS-4000mini型發光成像分析儀曝光顯影。用 quantity one 分析軟件對各組條帶進行分析，將各組的整合灰度比例與內參（ GAPDH） 比較，并以 GAPDH的 ID 為 100% ，得到相對百分數（ 即 ID/內參 ID ×100%） 。

1.4 統計學分析

數據均以均數 ± 標準差（ mean ± SD） 表示，所得數據均采用 SPSS 13.0 統計軟件進行分析。2組之間均數的比較采用單因素方差分析及 Bonferroni 法，以P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同溫度對海馬神經細胞存活率的影響

37℃組12h/24h海馬神經細胞平均存活率為99.43%、71.33%，42℃組12h/24h海馬神經細胞平均存活率為93.28%、60.88%，42℃組低于同時點37℃組細胞存活率，12h2組間比較P=0.002，24h2組間比較P=0.005，差異均有顯著統計學意義。

2.2 不同溫度對海馬神經細胞凋亡率影響及細胞形態改變

37℃組12h/24h海馬神經細胞平均凋亡率為1.23%、5.67%，42℃組12h/24h海馬神經細胞平均凋亡率為51.67%、68.36%，42℃組高于同時點37℃組細胞凋亡率，12h2組間比較P=0.0022，24h2組間比較P=0.034，差異均有統計學意義。凋亡細胞鏡下可見染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質凝聚、分塊，胞質皺縮，核呈圓形或新月形，有的核外周深染而中央淡染（如圖1）。

2.3 不同溫度對海馬神經細胞Bcl-2、Bax、cleaved-caspase 3蛋白表達影響

42℃組12h/24h海馬神經細胞Bax表達較37℃同時間點明顯增加，12h2組間比較分別是P=0.0395<0.05，24h2組間比較分別是P=0.021<0.05（見圖2A）。42℃組Bcl-2蛋白表達下調，12h2組間比較P=0.0086<0.01，24h2組間比較P=0.003<0.01，差異均有顯著統計學意義（見圖2B）。42℃組12h/24h海馬神經細胞cleaved-caspase3蛋白表達較37℃同時間點明顯增加，12h2組間比較分別是P=0.0239<0.05，24h2組間比較分別是P=0.0088<0.01（見圖2C）。

3 討論

在一定條件下，高溫對人體的損害是不可逆轉的，而這些不可逆的損害有可能是通過細胞凋亡實現的[4]。細胞凋亡又稱為程序化細胞死亡，是細胞生物有機體為調控機體發育，維持內環境穩定，由基因控制的細胞主動性死亡過程[5]。高溫誘發細胞凋亡的發生機制，一方面是直接影響細胞結構，另一方面與某些基因異常表達有關。

高溫誘導機體細胞損傷程度與熱的程度相關，極度高溫（49℃～50℃以上）可導致細胞在5min內以壞死方式死亡，而當環境溫度在 41.6℃～42℃時，細胞死亡方式以凋亡為主[6]。本實驗從細胞形態和相關蛋白變化，觀察溫度對海馬神經細胞的影響。光鏡下可見高溫改變了神經細胞結構，其中細胞核的改變最具特征性。CCK8、TUNEL結果表明，高溫可降低神經細胞存活率，加快凋亡，且溫度越高細胞存活率越低，凋亡率越高。隨著時間延長，細胞存活率明顯下降，細胞凋亡數增多。陳光忠等[7]研究顯示，高溫處理的大鼠海馬錐體細胞，凋亡率增加，且溫度越高、時間越長凋亡率越高，結論與本實驗結果一致。近年研究顯示PI3K/Akt信號轉導途徑在細胞的存活、增殖、凋亡以及細胞骨架變化等[8]活動中發揮重要的生物學功能，其機制可能包括：①調節Bcl-2家族成員的活性；②抑制caspase家族導致的細胞凋亡；③活化的Akt抑制GSK-3活性，加速凋亡；④活化的Akt抑制線粒體釋放如細胞色素C、AIF等凋亡相關因子，抑制凋亡；⑤活化轉錄因子NF-κB促進細胞增殖，抑制細胞凋亡等。

Bcl-2蛋白家族有抑制細胞凋亡基因（Bcl-2，Bcl-xl等），有促進細胞凋亡基因（Bax，Bad等）[9-10]。凋亡的各種信號轉導途徑有一個共同的通路或交匯點，而該通路或交匯點受Bcl-2調節。Bcl-2通過干擾細胞色素C自線粒體的釋放，阻斷caspase蛋白酶連鎖反應的激活，進而抑制細胞凋亡[11]。

Caspase家族是細胞凋亡下游關鍵酶，caspase3是該家族中細胞凋亡的主要效應因子， 與其他的caspases以級聯反應方式， 主要作用在細胞凋亡的執行階段，是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶[12-13]。本研究采用Western blot檢測蛋白Bax、Bcl-2及cleaved-caspase3的表達情況，結果顯示高溫能干擾這些蛋白的表達，隨著溫度升高，Bax、cleaved-caspase3表達增加，Bcl-2表達降低，隨著時間延長變化更為明顯。表明Bcl-2有保護細胞免受凋亡的作用。Strasser等[14]報道，Bc1-2基因表達可以使熱誘導的細胞凋亡下降，并促使細胞繼續增殖，形成熱耐受。崔寶林[15]等報道，熱療可顯著抑制 Bcl-2通路，促進細胞凋亡，與本實驗結果相符。隨著加熱時間延長cleaved-caspase3活性變化與細胞凋亡趨勢一致，說明caspase3參與了高溫誘導的海馬神經細胞凋亡；Lecchi C等[16]發現，隨著溫度升高，活化后的caspase3表達逐漸增強，其表達趨勢與神經元細胞凋亡一致。朱曄晶等[17]報道，熱處理人ECV304 后，caspase3隨著時間的增加其活性變化與細胞凋亡趨勢一致，與本實驗結論相符。

綜上所述，高溫可誘導海馬神經細胞凋亡，隨著溫度的升高及時間的延長，細胞凋亡數增加。Bcl-2、Bax、caspase 3蛋白是PI3K/Akt信號轉導途徑中調節蛋白，可能是通過PI3K/Akt信號轉導途徑誘導神經元細胞凋亡，Akt是該傳導通路的下游靶激酶，可進一步觀察Akt等相關蛋白明確其在海馬神經元細胞損傷中的作用。

參 考 文 獻

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