Notch1基因在宮頸癌組織中的表達及臨床意義

樓朝霞 梅麗娜 杜英? 胡慶偉 趙清 邢建民

Notch1基因在宮頸癌組織中的表達及臨床意義

樓朝霞 梅麗娜 杜英? 胡慶偉 趙清 邢建民

目的 研究Notch1基因在不同宮頸組織中的表達，探討其在宮頸癌發生發展中的意義。方法 分別采用免疫組化和熒光實時定量PCR檢測27例子宮頸癌、33例宮頸上皮內瘤變和19例正常宮頸組織中Notch1基因的表達情況。結果 免疫組化檢測Nocth1蛋白在宮頸癌、宮頸上皮內瘤變組及正常宮頸癌組的表達率分別為63.0%、45.5%、15.8%，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；熒光實時定量PCR檢測宮頸癌、宮頸上皮內瘤變組織及正常宮頸組織中Notch1 mRNA含量分別為（5.10±1.91）、（3.24±0.69）、（2.07±0.40），組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。宮頸癌Notch1mRNA的高表達與患者年齡、組織學分級、臨床分期差異均無統計學意義（P＜0.05）。結論 Notch1mRNA的高表達與宮頸組織的惡變演進有關，在子宮頸癌的發生、發展上起重要作用。

Notch1 宮頸癌 熒光實時定量PCR 免疫組化

宮頸癌是婦科三大惡性腫瘤之一，全國宮頸癌患者數逐年增加，且患病婦女呈年輕化的趨勢。因此宮頸癌的早期診斷、早期治療顯得非常重要［1］。尋找新的腫瘤標記物和治療靶點已成為基礎研究者和各級臨床醫師關注的一個焦點。目前大量研究證明Notch信號通路作為致瘤因素與多個系統的腫瘤發生相關，同時，其又在某些組織的腫瘤發生中起到抑瘤作用［2-3］。Notch1信號轉導通路與腫瘤之間關系密切，但其與宮頸癌的相關研究國內報道尚少［3-4］，因此本資料通過免疫組化與RT-PCR技術檢測Notch1信號轉導通路在不同宮頸組織中的表達情況，結合相關的臨床病理資料，進一步探討與宮頸癌發生發展之間的關系。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2010年1月至2014年5月本院的手術新鮮標本，分為子宮頸癌組（27例）、宮頸上皮內瘤變組（CIN）（33例）和正常對照組（19例）。宮頸癌臨床診斷按國際婦產科聯盟（FIGO）手術病理標準（其中Ⅰ期14例，Ⅱ期8例，Ⅲ期5例）。宮頸癌標本術前均未經化療、放療及免疫治療等。

1.2 方法 （1）組織制備：從活體上取下的組織（250～500mg）在15min內用液氮浸沒以便迅速降溫，液氮運輸。體積較小的組織用RNA later保存，干冰運輸。（2）Total總 RNA的提取（按R mirVana-RNA Isolation Kit（Applied Biosystem p/n AM1556的試劑盒進行操作）：加入10倍體積的lysis/binding buffer（1ml lysis/binding buffer/0.1g組織）勻漿器徹底混勻。加200μl氯仿，充分混勻，15000r/min離心5～7min。取上清液，置入1.5ml Eppendorf管加600μl氯仿，混勻，15000r/min離心5min。取上清液液，置入1.5ml Eppendorf管加500ul異丙醇，混勻，15000r/min離心10min。棄上清液，用75%乙醇1ml沖洗，高速離心5min。棄上清液，RNA沉淀于空氣中干燥（2～3min）。將干燥后的RNA溶解于DEPC處理水中，于-80℃冰箱保存。（3）頸環逆轉錄引物及熒光探針引物設計與合成：數據庫中各目的基因的序列（NM_017617），引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設計，由公司合成；DEPC由美國Sigma公司生產。在共焦顯微拉曼光譜儀（Renishaw 1000）上檢測熒光。逆轉錄過程嚴格按照試劑盒進行。（由Invitrogen提供）。上游引物：TCCAGCAGTCTCCGTCCGTG；下游引物：GGACCCGCCCACAGTGAAAT。（4）特異mRNA的熒光定量PCR技術的建立及優化熒光PCR：采用SYBRGreen 熒光染料做常規實時定量PCR，ABI Vii7 realtime PCR system實時檢測熒光強度的變化。PCR反應體系：H2O6.4μl，KAPA SYBR FAST Qpcr Master Mix（2×）8μl，Primer（up10pM/ul）0.2μl，Primer（down10pM/ ul）0.2μl，Template（就是反轉錄產物，也即cDNA）1μl，ROX0.2μl。反應條件為95℃預變性 2min，94℃變性 10s，60℃ 退火10s，72℃ 延伸45s，循環50次，最后72℃ 終末延伸10min，4℃保存后再分析結果。擴增完畢后根據熒光曲線計算相對比值。（5）正常組織mRNA及癌組織檢測：采用共焦顯微拉曼光譜儀（Renishaw 1000）進行檢測熒光。氬離子激光器488 nm 線為激發光源，背反式為其檢測方式。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果 Notch1在宮頸癌、CIN組、正常對照組的表達率，見表1。Notch1在不同宮頸組織中的表達情況，見圖1。

表1 宮頸癌、CIN組與正常對照組的Notch1免疫組化表達率（n）

圖1 Notch1在不同宮頸組織中的免疫組化表達情況

2.2 實時定量PCR結果 總RNA提取經電泳掃描分析可見清晰完整的兩條條帶，所提取的RNA符合實驗要求。根據宮頸癌細胞株的內參，建立 Notch1的標準曲線。宮頸癌組織中Notch1 mRNA的含量（5.10±1.91），CIN中的含量（3.24±0.69），正常對照組則是（2.07±0.040）。統計學分析宮頸癌組和CIN組織中Notch1 mRNA的含量明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。宮頸癌組和CIN組比較Notch1 mRNA的含量，差異有統計學意義（t=-1.858，P＜0.05）。

2.3 子宮頸癌組不同的組織分型和臨床分期Notch1的表達 見表2。

表2 研究組不同組織分型和臨床分期Notch1 mRNA的表達情況

3 討論

Notch基因首次發現于1917年，其突變可以造成果蠅的殘翅，1983年Artavanis Tsakonas研究組首次克隆了該基因［2］。Notch信號通路在進化上相對保守，其家族的受體和配體通過局部細胞間的相互作用調節無脊椎和脊椎動物個體的發育和內環境穩定［2-3］。Notch信號通路的主要途徑表現在：當Notch受體與配體結合后，活化的Notch受體直接轉至核內，與轉錄調節因子結合而激活靶基因，其過程并不需要第二信使，但是其有多種配體共同存在；激活Notch可引發多種信號；多種調節因素可通過不同機制調節Notch信號。同時，研究發現Notch對個體細胞的作用效應（誘導增殖或生長停滯、促進或抑制分化等）與信號通量和細胞所處環密切相關［4-5］。目前研究，高危乳頭狀瘤病毒（HPV）感染及持續表達E6/E7癌基因與宮頸癌的發生高度相關，活化的Notch 1信號路徑能協同E6/E7導致癌腫形成。在HPV陽性的宮頸癌細胞中，低水平表達的Notch 1 IC能促進腫瘤生長，而持續激活Notch 1信號卻能誘導腫瘤細胞生長抑制。在正常宮頸上皮，Notch1表達較低，而在宮頸癌細胞中高表達，提示Notch 1信號的激活在宮頸癌發生發展中起重要作用［6-7］。Talora等［8］發現HPV癌細胞可將低水平的Notch 1信號表達成抗凋亡反應的同時能將激活的部分Notch 1信號去除。說明能通過改變細胞環境抑制腫瘤細胞的生長，為宮頸癌的基因治療開辟新的方法。

Notch信號傳導通路作為藥物靶點通過深入研究疾病發生的分子機制與Notch信號傳導通路的關系，以Notch信號傳導通路作為藥物靶點進行治療研究，可以達到治療相關疾病的目的［9］。如今，Notch信號傳導的活化已證明與多種腫瘤的發生發展有關，治療與Notch相關的腫瘤，可以將Notch信號傳導通路作為選擇性殺死腫瘤細胞的活性靶點，通過阻斷Notch信號抑制腫瘤細胞的增殖，針對Notch受體的單克隆抗體（mAbs）也可以作為抑制劑阻斷Notch信號通路，已證明兔抗rh11-12的mAbs可以有效地阻斷3T3 L1細胞的分化［10-11］。

本研究通過使用免疫組化及RT-PCR技術分析不同宮頸組織中NOTCH1基因的表達狀況，發現NOTCH1的基因表達水平在正常宮頸組織、CIN及宮頸癌中呈上升趨勢，差異具有統計學意義（P＜0.05）。說明隨著疾病的發生，NOTCH1基因的表達水平逐漸升高，NOTCH1基因參與了在宮頸癌的早期發生過程，對宮頸癌的早期預防具有重要意義。同時研究發現NOTCH1基因的表達狀況與有關生物學標記物的關系，即在組織分級中，分化程度越低、NOTCH1基因表達的平均水平越高，而在臨床分期中，級別越低，NOTCH1基因表達的水平越高，說明NOTCH1基因在宮頸癌的演變過程中亦起到非常重要的作用，。雖然Notch1mRNA的高表達與患者年齡、組織學分級、臨床分期的差異不明顯，但其表達的統計學意義可能受限于樣本量的缺乏，還有待擴充樣本量進一步研究。

［1］ 萬磊,萬建平,張燕玲,等.子宮頸癌年輕化趨勢的臨床分析.中國腫瘤臨床,2004,31(10):547-549.

［2］ Artavanis-Tsakonas S,Rand MD,Lake RJ.Notch signaling: cell fate control and signal integration in development.Science, 1999, 284(5415):770-776.

［3］ Kojika S, Griffin JD. Notch receptors and hematopoiesis.Exp Hematol, 2001,29(9):1041-1052.

［4］ Wharton KA,Johansen KM,Xu T,et al.Nucleotide sequence from the neurogenic locus notch implies a gene product that shares homology with proteins containing EGF-like repeats.Cell,1985, 43(3 Pt 2):567-581.

［5］ Sitnik K,Cichy J.Role of Cre-loxP-mediated conditional gene targeting in understanding the function of Notch receptors.Postepy Biochem,2006,52(1):49-55.

［6］ Roy M,Pear WS,Aster JC.The multifaceted role of Notch in cancer.Curr Opin Genet Dev,2007,17(1):52-59.

［7］ Nair P,Somasundaram K,Krishna S.Activated Notch1 inhibits p53-induced apoptosis and sustains transformation by human papil-lomavirus type 16 PI3K-PKB/Akt-dependent pathway.J Virol,2003,77(12):7106-7112.

［8］ Talora C,Cialfi S,Segatto O,et al.Constitutively active Notch1 induces growth arrest of HPV-positive cervical cancer cells via sep-arate signaling pathways, Exprimental cell Research, 2005, 305(2):343-354.

［9］ Zlobin A,Jang M,Miele L.Toward the rational design of cell fate modifiers:Notch signaling as a target for novel biopharmaceuticals. Curr Pharm Biotechnol, 2000,1(1):83-106.

［10］ Bertelsen BI,Steine SJ,Sandvei R,et al.Molecular analysis of the PI3K-AKT pathway in uterine cervical neoplasia:frequent PIK3CA amplification and AKT phosphorylation.Int J Cancer, 2006, 118(8):1877-1883.

［11］ Purow B.Notch inhibition as a promising new approach to cancer therapy.Adv Exp Med Biol,2012,727:305-319.

Objective This study aimed to determine the expression profiles of Notch1 gene in different tissues of the cervix，including cervical carcinoma，cervical intraepithelial neoplasia and normal endometrium，and to examine explore its significance in cancer development occurs. Methods Immunohistochemistry and fluorescence quantitative PCR（RT-PCR）were used to detect the expression of Notch1 genes in 27 cases of cervical cancer，33 cases of cervical intraepithelial neoplasia（CIN）and 19 cases of normal cervical tissue. Results Immunohistochemistry showed the expression of Nocth1 protein in cervical cancer，cervical intraepithelial neoplasia and normal cervical group was respectively 63.0%，45.5%，15.8%，the difference between the two groups were statistically significant（P＜0.05）；real-time PCR detection the Notch1 mRNA contents of cervical cancer，cervical intraepithelial neoplasia and normal cervical tissues were 5.10±1.91，3.24±0.69，2.07±0.40，differences between groups were statistically significant（P＜0.05）. The relation of the high expression of Notch1mRNA is related to the age，histological grade，clinical stage（P＜0.05）. Conclusions The high expression of Notch1mRNA in cervical tissue is related to the occurrence of the malignant evolution and play an important role in the development of cervical cancer.

Notch1 Cervical carcinoma Real-time quantitatie polymerase chain reaction（RT-PCR） Immunohistochemistry

浙江省人口及計劃生育項目［（2011）50號］

313000 浙江省湖州市婦幼保健院婦產科

*通信作者