黃芩素中有關物質的檢測及其降解機制初步研究Δ

王瑋玨，董武軍，張培成，蘇倩倩，范茹涵，劉玉玲#（.中國醫學科學院/北京協和醫學院藥物研究所藥物傳輸技術及新型制劑北京市重點實驗室，北京 00050；.中國醫學科學院/北京協和醫學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 00050；.鄭州大學藥學院，鄭州 45000）

黃芩素中有關物質的檢測及其降解機制初步研究Δ

王瑋玨1＊，董武軍1，張培成2，蘇倩倩1，范茹涵3，劉玉玲1#（1.中國醫學科學院/北京協和醫學院藥物研究所藥物傳輸技術及新型制劑北京市重點實驗室，北京 100050；2.中國醫學科學院/北京協和醫學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050；3.鄭州大學藥學院，鄭州 450001）

目的：建立黃芩素中有關物質的分離檢測方法，鑒定其結構并初步探討降解機制。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）檢測黃芩素與合成過程中的有關雜質及強制破壞降解產物：色譜柱為ES Industries?FluoroSep-RP Phenyl，流動相為0.3%甲酸-甲醇-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為275 nm，柱溫為10℃，進樣量為10 μL。采用LC-串聯質譜法鑒定有關物質并推測降解機制：色譜柱為ES Industries?FluoroSep-RP Phenyl，流動相為0.3%甲酸-甲醇（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為275 nm，柱溫為10℃，進樣量為10 μL；離子源為電噴霧離子源，正負離子同時檢測，霧化器壓力為55 psi，干燥氣體流速為11 L/min，干燥氣體溫度為350℃，毛細管電壓為4.0 kV，檢測模式為全掃描一級質譜和選擇離子全掃描二級質譜，掃描范圍為m/ z 100～1 000（一級質譜），50～500（二級質譜），電離電壓為80～135 eV，碰撞能量為10～30 eV。結果：黃芩素檢測質量濃度線性范圍為2.4～480 μg/mL（r＝0.999 9）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；定量限、檢測限分別為7.2、2.4 ng。黃芩素與有關物質及3個主要降解產物分離良好，有關物質為化學合成前體木蝴蝶素；堿降解產物為6，7位鄰醌衍生物和7，8位鄰醌衍生物，兩者互為異構體；氧化降解產物為苯甲酸苯酯類衍生物。結論：黃芩素堿降解和氧化降解的主要機制包括吡喃環開環、互變重排和氧化反應等；該研究所建方法專屬性好、靈敏度高，可用于黃芩素有關物質的分離檢測。

黃芩素；有關物質；降解機制；高效液相色譜法；液相色譜-串聯質譜法

黃芩素（Baicalein，BE）是黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的主要活性成分之一，分子式為C15H10O5，化學名為5，6，7-三羥基黃酮（5，6，7-Trihydroxyflavone），化學結構見圖1。研究表明，黃芩素具有顯著的抗菌、抗病毒、清除自由基、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保肝、保護神經元等藥理作用[1-4]，含有黃芩素成分的中藥制劑在臨床上已被廣泛用于治療細菌或病毒引起的急慢性腸炎、痢疾、上呼吸道感染、急慢性結膜炎等。但受溶解度低、化學性質不穩定等理化性質限制，黃芩素單一成分至今未能成藥。

圖1 黃芩素的化學結構Fig 1 Chemical structure of baicalein

黃芩素屬多羥基黃酮，分子結構中含有三個羥基，在溶液狀態尤其是堿性條件下極易發生化學降解，降解機制復雜。含有酚羥基的黃酮易被氧化為醌類衍生物，由于降解產物結構的特殊性，且通常為系列降解產物，高效液相色譜法（HPLC）常用的C18、C8、苯基、腈基、氨基等色譜柱往往難以對降解產物進行有效分離與檢測。文獻采用HPLC考察黃芩素在不同pH的Krebs-Ringer試液中的穩定性，發現在pH 6.0、6.8、7.4條件下藥物含量均顯著降低，但該報道未對降解產物進行測定[5]。另有文獻通過紫外光譜研究光照、溫度、pH及抗氧化劑對黃芩素穩定性的影響，發現在光照和堿性條件下黃芩素溶液的吸光度值顯著下降，其含量明顯降低，但該文獻亦未對黃芩素降解產物進行分離檢測和結構鑒定[6]。有研究報道了黃芩素原料藥有關物質的HPLC分析方法，但最終僅鑒定檢測了千層紙素A，未能提供黃芩素的降解情況及降解產物結構信息[7]。本課題組曾參考文獻[7]方法對黃芩素有關物質進行考察，發現堿破壞降解產物多、峰形差且堆積在溶劑峰后，難以有效分離，無法滿足有關物質測定要求。

雖然普遍認為黃酮類化合物的降解產物多為醌類結構[8-9]，但關于黃芩素的降解產物類型及其結構至今尚不清楚。而關于黃芩素系列降解產物的有效分離與檢測，國內外亦均未見文獻報道，這在一定程度上影響了黃芩素制劑的開發和臨床應用。本課題組以全合成的黃芩素為試驗樣品，擬通過優化HPLC色譜條件，實現黃芩素與工藝雜質及破壞降解產物的有效分離；并進一步結合二極管陣列（DAD）紫外光譜分析和液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）一級、二級質譜信息收集，對降解產物進行結構鑒定，由此推測黃芩素降解機制，為后續的黃芩素制劑研發提供準確、科學的質量控制方法。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀（包括DAD檢測器、自動進樣器、柱溫箱）、1200型LC-6410型三重串聯四級桿質譜儀（包括DAD二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱溫箱、電噴霧離子源、三重四級桿質譜儀）均購自美國Agilent公司；XS105 Dual Range型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試劑

黃芩素原料藥（中國醫學科學院藥物研究所自制，批號：HJ73）；黃芩素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111595-200905，純度：98.5%）；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取黃芩素對照品12 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取黃芩素原料藥12 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.1.3 強制破壞樣品溶液 精密稱取黃芩素原料藥60 mg，加甲醇溶解并定容至25 mL，作為貯備液，備用。①酸破壞樣品溶液：精密量取上述貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸1 mL，30℃水浴加熱30 min，再加甲醇定容，搖勻，即得。②堿破壞樣品溶液：精密量取上述貯備液1 mL，置于10 ml量瓶中，加0.01 mol/L氫氧化鈉0.5 mL，30℃水浴加熱20 min，加0.01 mol/L鹽酸0.5 mL中和，再加甲醇定容，搖勻，即得。③氧化破壞樣品溶液：精密量取上述貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加10%過氧化氫1 mL，30℃水浴加熱30 min，再加甲醇定容，搖勻，即得。④高溫破壞樣品溶液：精密量取上述貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，置于80℃烘箱中加熱24 h，冷卻后加甲醇定容，搖勻，即得。⑤光照破壞樣品溶液：精密量取上述貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，于（4 500±500）lx強光下照射24 h，再加甲醇定容，搖勻，即得。

2.2 有關物質分離檢測

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ES Industries?FluoroSep-RP Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.3%甲酸溶液（A）-甲醇（B）-乙腈（C），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫：10℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Program of gradient elution

2.2.2 專屬性試驗 分別量取“2.1”項下供試品溶液和強制破壞樣品溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖2。結果表明，樣品在各強制降解條件下產生的主要降解產物與黃芩素分離良好，主要降解產物之間均有效分離，分離度均＞1.5，理論板數均≥10 000，表明本方法專屬性良好，能夠將降解產物有效分離，滿足有關物質測定要求。

2.2.3 線性關系考察 精密稱取黃芩素對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為2.4、4.8、24、48、120、240、480 μg/mL的系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以黃芩素質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得黃芩素回歸方程為y＝56.42x－24.37（r＝0.999 9）。結果表明，黃芩素檢測質量濃度線性范圍為2.4～480 μg/mL。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

2.2.4 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察 取“2.2.3”項下質量濃度為24 μg/mL的對照品溶液，逐級稀釋，精密量取各級對照品溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ為7.2 ng；當信噪比為3∶1時，得LOD為2.4 ng。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.3”項下質量濃度為240 μg/mL對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，黃芩素峰面積的RSD＝1.4%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液、“2.2.3”項下質量濃度為240 μg/mL對照品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，供試品、對照品溶液中黃芩素峰面積的RSD分別為1.5%、1.4%（n＝5），表明供試品、對照品溶液未產生新的雜質，溶液在8 h內基本穩定。

2.2.7 重復性試驗 精密稱取黃芩素對照品適量，加甲醇制成含量為100%的供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，黃芩素峰面積的RSD＝1.3%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.2.8 樣品中雜質的測定 精密稱取黃芩素原料藥12 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為供試品溶液；精密量取上述供試品溶液1 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，作為對照溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。分別精密量取上述供試品溶液、對照品溶液各10 μL，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以不加校正因子的主成分自身對照法計算雜質含量。結果表明，黃芩素原料藥中單個最大雜質的含量為2.08%，總雜質含量為2.37%。

2.2.9 有關物質來源分析及紫外光譜測定 由圖2可知，黃芩素強制破壞樣品中主要有4個雜質，其保留時間分別為11.5、12.6、15.4、27.0 min，依次命名為雜質1、雜質2、雜質3、雜質4。在酸破壞和光照破壞條件下，黃芩素未產生明顯的降解產物，表明其對酸、光照的穩定性良好；黃芩素在堿破壞和高溫破壞條件下主要形成雜質1、雜質2，氧化破壞主要形成雜質3，表明堿、氧化條件對黃芩素穩定性的影響最為顯著；在各強制破壞條件下，雜質4的含量均未見明顯改變，推測該雜質可能為合成過程中產生的副產物。

取“2.1”項下供試品溶液、強制破壞樣品溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件（檢測波長為200～400 nm）連續進樣測定6次，記錄DAD吸收曲線，詳見圖3。結果，雜質1、雜質2、雜質3的紫外光譜形態和最大吸收均與黃芩素有明顯差異，表明其共軛骨架結構與黃芩素不同；而雜質4具有典型的黃酮化合物紫外光譜特征，且與黃芩素相似，表明其化學結構與黃芩素相近。

圖3 DAD吸收曲線Fig 3 DAD absorption spectrum

2.3 有關物質結構鑒定及降解機制推測

2.3.1 LC-MS/MS條件 ①色譜條件。色譜柱：ES Industries?FluoroSep-RP Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.3%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫：10℃；進樣量：10 μL。該色譜條件下獲得的色譜與“2.2”項下的HPLC色譜一致性良好。②質譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI），正負離子同時檢測；霧化器壓力：55 psi；干燥氣體流速：11 L/min；干燥氣體溫度：350℃；毛細管電壓：4.0 kV；檢測模式：全掃描一級質譜（Scan）和選擇離子全掃描二級質譜；掃描范圍m/z一級質譜100～1 000，二級質譜50～500；電離電壓：80～135 eV；碰撞能量：10～30 eV。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Program of gradient elution

2.3.2 結構鑒定和降解機制推測 黃芩素在堿、氧化條件下的降解最為顯著，因此分別量取“2.1.3”項下堿破壞、氧化破壞樣品溶液各適量，按“2.3.1”項下試驗條件連續進樣測定6次，記錄色譜、總離子流（TIC），詳見圖4、圖5。

圖4 堿破壞樣品的圖譜Fig 4 Atlas of samples destroyed by alkaline

圖5 氧化破壞樣品的圖譜Fig 5 Atlas of samples destroyed by oxidation

由圖4、圖5可知，在LC-MS/MS系統中，黃芩素主峰及主要雜質的保留時間、出峰順序與HPLC系統基本一致。通過TIC圖提取與雜質1～4對應的一級質譜和二級碎片信息，鑒定雜質結構并分析降解機制。各雜質的一級、二級質譜分別見圖6、圖7。

雜質1和雜質2的一級質譜高度相似（如圖6A和B所示），均可觀察到m/z 171、210、241、267[M-H-H2O]－、285[M-H]－，可知雜質1、雜質2的分子量為286。雜質1和雜質2的母離子（m/z 285）產生的二級碎片（-ESI）分別如圖7A和B所示，由285[M-H]－脫去H2O產生碎片m/z 267，再脫去CO產生m/z 239，碎片質量數和相對豐度基本相同，故推測二者是同分異構體。黃芩素的分子量為270，此分子量286比黃芩素多16，可能是1個氧原子，結合DAD吸收曲線可知，二者的紫外光譜只有一個吸收峰，表明不具有黃酮母體共軛結構，雜質1和雜質2可能的結構、裂解途徑見圖8。由于化合物的保留時間與極性相關，在反相HPLC中雜質2的保留時間比雜質1大，表明雜質2的極性較小，推測雜質2是分子偶極較小的7，8位鄰醌式結構，而雜質1是分子偶極較大的6，7位鄰醌式結構，二者是一對異構體。

圖6 雜質的一級質譜圖Fig 6 First-order MS of impurities

圖7 雜質的二級質譜圖Fig 7 Second-order MS of impurities

圖8 黃芩素堿降解機制及雜質1、雜質2的結構、裂解途徑Fig 8 Alkaline degradation mechanism of baicalein and structures and fragmentation pathways of impurity 1，impurity 2

雜質1和雜質2是黃芩素的堿降解產物，據此推測堿降解機制為在堿性條件下，黃芩素C環發生開環反應，產生類似查爾酮的中間結構，通過Wessely-Moser重排反應[10，11]生成互變異構體，同時A環羥基在空氣中氧的作用下氧化成醌，生成雜質1和雜質2。

雜質3的一級質譜（+ESI）如圖6 C所示，可觀察到m/z 247[M+H]+、269[M+Na]+，故分子量為246。雜質3母離子（m/z 247）的二級碎片如圖7 C所示，由m/z 247脫去H2O產生碎片m/z 229，再依次脫去CO產生碎片m/z 201 [M+H-H2O-CO]+和m/z 173[M+H-H2O-2CO]+。雜質3的DAD吸收曲線有2個吸收峰，與黃芩素相比，其最大吸收波長發生藍移，表明雜質3共軛鏈縮短，可能不具有黃酮母核結構，其可能的結構和裂解過程見圖9。

圖9 黃芩素氧化降解機制及雜質3的結構、裂解途徑Fig 9 Oxidative degradation mechanism of baicalein and structure and fragmentation pathway of impurity 3

雜質3由黃芩素氧化降解產生，推測氧化降解機制為在過氧化氫作用下，黃芩素的C環發生開環反應，A環脫去羥基，2，3位碳-碳雙鍵被氧化，產生苯甲酸苯酯類產物。

雜質4的一級質譜（+ESI）如圖6D所示，可觀察到m/z 285[M+H]+、307[M+Na]+，故分子量為284；其母離子（m/z 285）的二級質譜如圖7D所示，由m/z 285脫去CH3產生m/z 270，再通過逆狄爾斯-阿德爾反應（RDA）裂解產生m/z 168，m/z 168丟失CO產生碎片離子m/z 140，因此可確定雜質4含有甲氧基[12]，推測為黃芩素A環羥基被甲氧基取代的黃酮類化合物；雜質4的紫外吸收光譜與文獻報道的木蝴蝶素一致[13]，結合原料藥合成工藝路線[14]，推測雜質4是黃芩素的化學合成前體——木蝴蝶素，其結構及可能的裂解過程見圖10。

圖10 雜質4的結構、裂解途徑Fig 10 Structure and fragmentation pathway of impurity 4

3 討論

黃酮類化合物化學降解機制復雜，采用不同降解條件所得的產物不同，鑒定降解產物的結構困難，文獻報道黃芩素易被氧化為醌類衍生物而顯綠色[15]，但黃芩素在不同條件下降解所得的產物結構和降解機制至今尚不清楚。本研究通過HPLC-DAD、LC-MS/MS對黃芩素強制降解產物進行分析和結構鑒定，并以此推測其降解機制，結果表明：（1）在堿性條件下，黃芩素吡喃環發生開環反應，經Wessely-Moser反應互變重排成異構體，同時A環酚羥基經空氣氧化，降解產生6，7位鄰醌類結構（雜質1）和7，8位鄰醌類結構（雜質2），兩者為互變異構體。（2）在氧化條件下，黃芩素吡喃環發生開環反應，2，3位雙鍵在過氧化氫作用下氧化斷裂，產生苯甲酸苯酯類結構（雜質3）。

本研究在HPLC法色譜條件優化中，考察了不同鍵合相填料的色譜柱，包括C18、C8、苯基、腈基、氨基、苯基己基和氟苯基柱，以及不同柱溫（10～40℃）對分離檢測結果的影響。結果發現，含苯基鍵合相的色譜柱及低溫有利于降解產物分離，不僅實現了主成分與工藝雜質及降解產物的分離，還實現了醌類降解產物及其互變異構體的相互分離；而其他色譜填料，黃芩素堿降解產物易堆積在溶劑峰后且峰形較差。推測原因，可能是由于醌類降解產物及其互變異構體的化學結構和分子極性都極為相近，而氟苯基色譜柱同時具有疏水作用、π-π電子相互作用及偶極誘導作用，對芳香和雜環化合物、共軛體系及異構體等產生獨特的分離機制，更有利于降解產物分離。因此，最終采用FluoroSep-RP Phenyl（FSP）氟苯基色譜柱，在柱溫10℃進行有關物質檢測分離。

本研究建立的HPLC法，能夠有效分離檢測黃芩素合成過程中的工藝雜質及系列降解產物，在此基礎上，對其主要降解產物進行了結構鑒定，推測了其降解機制。研究結果不僅為黃芩素制備工藝優化及質量控制提供了重要分析方法，同時對黃酮類化合物的有關物質及降解機制研究具有一定指導意義。

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Detection of Related Substances and Preliminary Study on the Degradation Mechanism of Baicalein

WANG Weijue1，DONG Wujun1，ZHANG Peicheng2，SU Qianqian1，FAN Ruhan3，LIU Yuling1（1.Beijing Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Novel Formulation，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences/Peking Union Medical College，Beijing 100050，China；2.State Key Laboratory of Bioactive Substances and Function of Natural Medicines，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences/ Peking Union Medical College，Beijing 100050，China；3.School of Pharmacy，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the separation and detection of related substances in baicalein，identify itsstructure and preliminarily explore the degradation mechanism.METHODS：HPLC was adopted to detect the baicalein，related impurities and forced destruction of degradation products in synthesis process：the column was ES Industries?FluoroSep-RP Phenyl with mobile phase of 0.3%formic acid-methanol-acetonitrile（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 275 nm，the column temperature was 10℃，and the injection volume was 10 μL.LC-MS/MS was conducted to identify the related substances and conjecture degradation mechanism：the column was ES Industries?FluoroSep-RP Phenyl with mobile phase of 0.3% formic acid-methanol（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 275 nm，column temperature was 10℃，and the injection volume was 10 μL；ion source was electrospray ion source，positive and negative ions，nebulizer pressure was 55 psi and the drying gas flow was 11 L/min，drying gas temperature was 350℃，capillary voltage was 4.0 kV，detection modes were full-scan first-order MS and selective ion full-scan second-order MS，scan ranges were m/z 100-1 000（first-order MS）and 50-500（second-order MS），ionization voltage was 80-135 eV，and the collision energy was 10-30 eV.RESULTS：The linear range of baicalein was 2.4-480 μg/mL（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；the limit of quantitation was 7.2 ng，the limit of detection was 2.4 ng.Baicalein was well separated with related substance and 3 major degradation products，the related substance was chemical synthesis precursor wood butterfly；the degradation products were 6，7-quinone derivatives and 7，8-quinone derivatives，which were isomers；oxidative degradation products were benzoic acid phenyl ester derivatives.CONCLUSIONS：The main mechanisms of alkali degradation and oxidative degradation of baicalein include pyran，reciprocal rearrangement and oxidation reaction；the established method is specific and sensitive，and can be used for the detection of related substances in baicalein.

Baicalein；Related substance；Degradation mechanism；HPLC；LC-MS/MS

R927

A

1001-0408（2017）06-0803-06

2016-04-27

2016-06-30）

（編輯：張 靜）

“重大新藥創制”科技重大專項（No.2012ZX09301002-001-008）；中央高校基本科研業務費專項“創新藥物發現與新技術專項”（No.2012CHX03）

＊碩士研究生。研究方向：納米給藥系統。電話：010-83160332。E-mail：doggiejue@163.com

#通信作者：研究員，博士生導師。研究方向：新型微粒載體構建及腫瘤靶向制劑等。電話：010-63159373。E-mail：ylliu@imm.ac.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.06.23