RP-HPLC法測定新扶正除疫顆粒中紅景天苷和虎杖苷的含量Δ

付美麗，嚴銘銘，邵 帥，吳程彥，劉 暢，田 雙，尉忠賢，楊 洋（長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研發中心，長春 130117）

RP-HPLC法測定新扶正除疫顆粒中紅景天苷和虎杖苷的含量Δ

付美麗＊，嚴銘銘#，邵 帥，吳程彥，劉 暢，田 雙，尉忠賢，楊 洋（長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研發中心，長春 130117）

目的：建立測定新扶正除疫顆粒中紅景天苷和虎杖苷含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為GRACE Alltima TMC 18，流動相為甲醇-水（15∶85，V/V，紅景天苷）、乙腈-水（23∶77，V/V，虎杖苷），流速為1.0 mL/min，檢測波長為275 nm（紅景天苷）、306 nm（虎杖苷），柱溫為25℃，進樣量為10 μL。結果：紅景天苷和虎杖苷檢測進樣量線性范圍分別為0.99～10.89 μg（r＝0.999 8）、0.046～1.196 μg（r＝0.999 8）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.31%～99.44%（RSD＝1.20%，n＝6）、95.96%～99.73%（RSD＝1.42%，n＝6）。結論：該方法操作簡單方便、結果準確可靠，適用于測定新扶正除疫顆粒中紅景天苷和虎杖苷的含量。

反相高效液相色譜法；新扶正除疫顆粒；紅景天苷；虎杖苷；含量測定

新扶正除疫顆粒原始劑型為湯劑，即扶正除疫湯，因其使用不便，本課題組對劑型進行了改造，制備了新扶正除疫顆粒。該制劑由紅景天、虎杖、大青葉、貫眾等中藥材組成，具有扶正祛邪、清熱透毒之功效；方中以紅景天為君，解毒達邪，先證用藥；以虎杖、大青葉為臣，清熱解毒、截斷病勢，結合貫眾的佐使之力，從而達到整體調節、多靶治療的目的，有效地阻斷多個病理環節的惡性循環[1-4]。為了更好地控制新扶正除疫顆粒的質量，本課題組參考相關文獻[5]，采用反相高效液相色譜法（RPHPLC）測定新扶正除疫顆粒中紅景天苷和虎杖苷的含量，以期為該制劑的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括紫外檢測器（美國Agilent公司）；AB265-S型、ALB-224型萬分之一分析天平均購自奧豪斯儀器（上海）有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器（功率：250 W；頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

新扶正除疫顆粒（長春中醫藥大學自制，批號：20140301、20140302、20140303、20140304、20140305，規格：10 g/袋）；紅景天苷對照品（批號：111920-201001，純度：99.8%）、虎杖苷對照品（批號：111575-200502，純度：100%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，無水乙醇、甲醇為分析純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 紅景天苷的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：GRACE Alltima TMC 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 溶液的制備 ①對照品溶液。精密稱取紅景天苷對照品9.9 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制備每1 mL含紅景天苷1.98 mg的對照品貯備液。取上述貯備液適量，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制備每1 mL含紅景天苷0.48 mg的對照品溶液。②供試品溶液。取樣品適量，研細，精密稱取細粉1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加甲醇10 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷；再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得[6]。③陰性對照溶液。按樣品的處方比例和制備工藝，制備不含紅景天苷的陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液[7]。

2.1.3 系統適用性試驗 精密量取“2.1.2”項下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數以紅景天苷峰計≥2 000，保留時間為18.656 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

龍血樹(Dracaena cambodian)屬于百合科龍血樹屬，樹葉為線狀披針形，簇生于枝條頂端，樹形極具特點，可塑性強，可以根據人的意愿塑造出不同形狀，樹干古樸滄桑，同時還能在頂部萌發新枝，給人一種沉穩而不失朝氣的感覺，且十分耐陰，可在室內盆栽多年仍然綠意盎然，是園林綠化及家庭盆栽的名貴樹種，具有很好的觀賞價值。同時藥用價值極高，具有止血、生肌、行氣等功效。

圖1 紅景天苷高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of salidroside

2.1.4 線性關系考察 取“2.1.2”項下對照品貯備液各0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.1 mL，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成質量濃度分別為0.099、0.198、0.396、0.594、0.792、0.990、1.089 mg/mL的系列對照品溶液。取上述對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得紅景天苷的回歸方程為y＝308.3x－42.301（r＝0.999 8）。結果表明，紅景天苷檢測進樣量線性范圍為0.99～10.89 μg。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（批號：20140302）10μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，紅景天苷峰面積的RSD＝0.42%（n＝12），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 取同一批供試品溶液（批號：20140304）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，紅景天苷峰面積的RSD＝1.43%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取樣品（批號：20140303）適量，按“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，紅景天苷的平均含量為0.41%，RSD＝0.86%（n＝6），表明本方法重復性良好[8-9]。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（批號：20140305）適量，精密加入一定質量的紅景天苷對照品，按“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 紅景天苷加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test of salidroside（n＝6）

2.1.9 樣品含量測定 取5批樣品各適量，分別按“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算紅景天苷的含量。結果，5批樣品（批號：20140301、20140302、20140303、20140304、20140305）中紅景天苷的含量分別為6.675‰、5.354‰、4.893‰、3.464‰、4.183‰（n＝3）。

2.2 虎杖苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：GRACE Alltima TMC 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（23∶77，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：306 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液的制備 ①對照品溶液。精密稱取虎杖苷對照品9.2 mg，置于50 mL量瓶中，加稀乙醇（取乙醇529 mL，加水稀釋至1 000 mL，即得稀乙醇溶液）溶解并定容，制備每1 mL含0.184 mg的對照品貯備液。取上述貯備液適量，置于100 mL量瓶中，加稀乙醇定容，制備每1 mL含虎杖苷0.03 mg的對照品溶液（避光放置）。②供試品溶液。取樣品適量，研細，取約0.25 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加稀乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷；再次稱定質量，用稀乙醇補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得（避光放置）。③陰性對照溶液。按樣品的處方比例和制備工藝，制備不含虎杖苷的陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.2.3 系統適用性試驗 精密量取“2.2.2”項下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5，理論板數以虎杖苷峰計≥3 000，保留時間為11.452 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖2 虎杖苷高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of polydatin

2.2.4 線性關系考察 取“2.2.2”項下對照品貯備液0.25、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加稀乙醇定容，搖勻，制成質量濃度分別為0.004 6、0.009 2、0.027 6、0.046 0、0.064 4、0.082 8、0.101 2、0.119 6 mg/mL的系列對照品溶液。取上述對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得虎杖苷的回歸方程為y＝308.3x－42.301（r＝0.999 8）。結果表明，虎杖苷檢測進樣量線性范圍為0.046～1.196 μg。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20140302）10μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，虎杖苷峰面積的RSD＝1.21%（n＝12），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取同一批供試品溶液（批號：20140304）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，虎杖苷峰面積的RSD＝0.70%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取樣品（批號：20140303）適量，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，虎杖苷的平均含量為0.75%，RSD＝1.22%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（批號：20140305）適量，精密加入一定質量的虎杖苷對照品，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.2.9 樣品含量測定 取5批樣品各適量，分別按

表2 虎杖苷加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test of polydatin（n＝6）

“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算虎杖苷的含量。結果，5批樣品（批號：20140301、20140302、20140303、20140304、20140305）中虎杖苷的含量分別為2.891‰、7.898‰、0.947‰、11.247‰、5.332‰（n＝3）。

3 討論

3.1 流動相的選擇

本課題組參考了相關文獻中紅景天苷的流動相：乙腈-水-磷酸[10]、乙腈-水[11]、甲醇-水[12]；虎杖苷的流動相：乙腈-水[13]、乙腈-0.5%乙酸、乙腈-0.1%磷酸-四氫呋喃[14]、甲醇-乙腈-0.1%甲酸[15]，結果，測定紅景天苷時以甲醇-水為流動相、測定虎杖苷時以乙腈-水為流動相的分離效果最好，并且柱效最高。因此，本試驗選擇甲醇-水（紅景天苷）、乙腈-水（虎杖苷）為流動相。

3.2 樣品提取方法的選擇

在提取方法的選擇上，本課題組分別用回流法、索氏回流法、超聲法對樣品中紅景天苷和虎杖苷進行提取。結果，采用回流法、索氏回流法、超聲法制備的供試品溶液所測得的待測成分含量相差不大，以超聲法測得待測成分的含量最高，且超聲法操作簡便，故兩種成分均選擇超聲法提取。

3.3 樣品提取溶劑的選擇

在提取溶劑的選擇上，課題組考察了甲醇、70%乙醇、水（紅景天苷），甲醇、稀乙醇、70%乙醇-乙酸乙酯（3∶1，V/V）（虎杖苷）。結果，紅景天苷以甲醇、虎杖苷以稀乙醇為溶劑時經超聲法提取最充分，且含量均較高。因此，本試驗選擇甲醇（紅景天苷）、稀乙醇（虎杖苷）為提取溶劑。

綜上所述，本方法操作簡單方便、結果準確可靠，適用于測定新扶正除疫顆粒中紅景天苷和虎杖苷的含量。

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Contents Determination of Salidroside and Polydatin in New Fuzheng Chuyi Granule by RP-HPLC

FU Meili，YAN Mingming，SHAO Shuai，WU Chengyan，LIU Chang，TIAN Shuang，YU Zhongxian，YANG Yang（Chinese Medicine and Bioengineering R&D Center，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the contents determination of salidroside and polydatin in new Fuzheng chuyi granule.METHODS：RH-HPLC was performed on the column of GRACE Alltima TMC 18 with mobile phase of methanolwater（15∶85，V/V，salidroside）and acetonitrile-water（23∶77，V/V，polydatin）at a flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength was 275 nm（salidroside）and 306 nm（polydatin），column temperature was 25℃，and the injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear range was 0.99-10.89 μg for salidroside（r＝0.999 8）and 0.046-1.196 μg for polydatin（r＝0.999 8）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 96.31%-99.44%（RSD＝1.20%，n＝6）and 95.96%-99.73%（RSD＝1.42%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reliable，and suitable for the contents determination of salidroside and polydatin in new Fuzheng chuyi granule.

RP-HPLC；New Fuzheng chuyi granule；Salidroside；Polydatin；Content determination

R917

A

1001-0408（2017）06-0809-04

2016-03-01

2016-10-11）

（編輯：劉 柳）

國家科技重大專項課題（No.2012ZX09103201-033）；吉林省科技發展計劃項目（No.20150204036YY）

＊碩士研究生。研究方向：中藥化學。E-mail：273575508@qq. com

#通信作者：教授。研究方向：中藥創新藥物。E-mail：yanmm 595@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.06.24