蒙藥益腎散的質量標準研究Δ

王美麗，海祺山，戴麗麗，田 香，白玉霞#（.內蒙古民族大學蒙醫藥學院，內蒙古通遼 0800；.通遼市科左中旗蒙醫醫院，內蒙古通遼 0900；.江西中醫藥大學藥學院，南昌 0004）

蒙藥益腎散的質量標準研究Δ

王美麗1＊，海祺山2，戴麗麗1，田 香3，白玉霞1#（1.內蒙古民族大學蒙醫藥學院，內蒙古通遼 028300；2.通遼市科左中旗蒙醫醫院，內蒙古通遼 029300；3.江西中醫藥大學藥學院，南昌 330004）

目的：建立蒙藥益腎散的質量標準。方法：采用薄層色譜法（TLC）對制劑中大黃、訶子進行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定制劑中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量：色譜柱為Inertsil C18，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為35℃，進樣量為10 μL。結果：大黃、訶子的TLC圖斑點清晰，分離度好。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚檢測進樣量線性范圍分別為23.55～117.75 ng（r＝0.999 9）、44.72～223.62 ng（r＝0.999 8）、43.18～215.90 ng（r＝0.999 7）、77.41～387.12 ng（r＝0.999 9）、46.02～230.10 ng（r＝0.999 7）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為95.80%～99.66%（RSD＝1.21%，n＝6）、95.01%～98.07%（RSD＝0.92%，n＝6）、95.06%～97.84%（RSD＝0.50%，n＝6）、95.19%～97.66%（RSD＝1.07%，n＝6）、95.07%～98.20%（RSD＝0.95%，n＝6）。結論：該研究所建標準可用于蒙藥益腎散的質量控制。

蒙藥益腎散；薄層色譜法；高效液相色譜法；含量測定

蒙藥益腎散是內蒙古通遼市科左中旗蒙醫醫院腎病科專家海祺山的傳統經驗方，主要由訶子、大黃、方海等蒙藥組成。該藥已在臨床應用40余年，主要用于急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能不全等癥的治療。多年來運用該藥每年治療患者量達3 000人次，治愈率達85%。

為更好地控制該制劑質量，保證臨床用藥安全、有效，筆者對其進行了質量標準研究，采用薄層色譜法（TLC）對制劑中的主藥大黃、訶子進行了定性鑒別，并以高效液相色譜法（HPLC）測定其中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量。

1 材料

1.1 儀器

LC-20ATvp型HPLC儀（包括SPD-M20Avp型檢測器、SHIMADZU-VP色譜工作站）、AUW220型電子分析天平（日本Shimadzu公司）；KQ-600DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；AUY120型電子分析天平（廣州市新英電器有限公司）；ZF-I型三用紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠）；JY02S型紫外分析儀（北京君意東方電泳設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

益腎散（通遼市科左中旗蒙醫醫院自制，批號：20110207、20110406、20110711，規格：25 g）；大黃酸對照品（批號：110757-201206，純度：≥98%）、大黃素對照品（批號：110756-201210，純度：≥98%）、大黃酚對照品（批號：110796-201209，純度：≥98%）、大黃素甲醚對照品（批號：758-201206，純度：≥98%）、蘆薈大黃素對照品（批號：14031201，純度：≥98%）、沒食子酸對照品（批號：110831-200302，純度：≥98%）、大黃對照藥材（批號：20120823）、訶子對照藥材（批號：20131106）均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G（青島海洋化工有限公司分廠）；羧甲基纖維素鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇為色譜醇，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 大黃 取樣品2.0 g，加甲醇20 mL浸泡1 h，濾過，取濾液5 mL，蒸干；殘渣加水10 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚分2次振搖提取，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷3 mL使溶解，經微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續濾液，即得供試品溶液[12]。另取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚對照品適量，加甲醇制成質量濃度均為1 mg/mL的單一對照品溶液。再取大黃對照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][2]試驗，吸取上述6種溶液各4～8 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯-甲酸（12∶8∶1，V/V/V）為展開劑，預飽和20 min，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，詳見圖1。

圖1 大黃的薄層色譜圖Fig 1 TLC of Rheum palmatum

2.1.2 訶子 取樣品2.0 g，加甲醇15 mL，超聲處理30 min，濾過，經微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得供試品溶液[3-4]。另取沒食子酸對照品適量，以甲醇為溶劑制成1 mL含1.5 mg的對照品溶液。再取訶子對照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。吸取上述3種溶液各4～8 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲酸（6∶4∶1，V/V/V）為展開劑，預飽和20 min，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，詳見圖2。

圖2 訶子的薄層色譜圖Fig 2 TLC of Terminalia chebula

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0.01～15 min，58%→60%A；15～40 min，60%→82%A；40～50 min，82%→70%A；50～55 min，70%→58%A）；流速：1.0 mL/mim；檢測波長：254 nm；柱溫：35℃；進樣量：10 μL[5-8]。

2.2.2 混合對照品溶液 分別精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚7.85、8.98、7.22、7.74、7.67 mg，各置于50 mL量瓶中，加甲醇制成蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚質量濃度分別為157.0、179.6、144.4、154.8、153.4μg/mL的單一對照品貯備液。精密吸取上述單一對照品貯備液適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚質量濃度分別為47.1、89.45、86.4、154.8、92.04μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取樣品1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過；揮干溶劑，殘渣加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，冷卻，置于分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中；分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取4次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 系統適用性試驗 取“2.2.2”“2.2.3”項下混合對照品溶液、供試品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖3。結果，供試品溶液與混合對照品溶液均在相同保留時間處出現蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚吸收峰，且與其他組分峰達到基線分離，分離度均＞1.5；理論板數以大黃素峰計＞3 000。

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

2.2.5 線性關系考察 分別精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（x，ng）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equation and linear ranges

2.2.6 精密度試驗 取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.85%、1.25%、0.88%、0.92%、1.20%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（批號：20110207）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.41%、1.60%、1.38%、1.63%、1.31%（n＝7），表明供試品溶液在室溫放置12 h內基本穩定。

2.2.8 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（批號：20110207）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚平均含量分別為0.48、0.66、0.85、1.48、0.53 mg/g，RSD分別為0.41%、0.60%、0.78%、0.74%、0.66%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（批號：20110207）適量，共6份，分別加入一定質量待測成分對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.10 樣品含量測定 取3批樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n＝3，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

制劑中大黃、訶子的TLC鑒別借鑒了2015年版《中國藥典》方法，展開劑比例作了適當調整，結果均能達到良好分離，斑點清晰，重復性好。

筆者采用HPLC測定制劑中5種蒽醌類成分的含量時，流動相的磷酸溶液設置范圍為0.1%～0.4%。結果，磷酸溶液體積分數為0.1%時色譜峰的對稱度較好。筆者曾比較了不同比例的乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水-磷酸等多種溶劑系統作為流動相，結果以甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相時，色譜峰形好，保留時間適宜，分離效果較好。

綜上所述，本研究所建標準可用于蒙藥益腎散的質量控制。

[1] 任偉光，王琦，黃林芳.大黃類藥材的質量評價進展[J].中南藥學，2014，12（4）：354-356.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：57-57.

[3] 張幸福，才毛，駱桂法，等.藏藥十味訶子丸的質量控制[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（9）：51-53.

[4] 李洋，吳劍坤，黃健，等.清肺丸顯微與薄層色譜鑒別研究[J].北京中醫藥，2013，32（6）：457-460.

[5] 杜連平，袁發榮.藏成藥青鵬膠囊質量標準研究[J].中成藥，2010，32（8）：1450-1452.

[6] 魏艷婷，張靜宜，張華潭.HPLC法同時測定三黃滴丸中5種蒽醌類成分的含量[J].中國藥房，2015，26（27）：3867-3869.

[7] 白玉霞，散丹，吳雙英.HPLC法測定蒙藥給喜古訥-6中大黃酸、大黃素及大黃酚的含量[C]//世界中醫藥聯合會中藥化學專業委員會.第二屆學術年會暨胡楊林論壇論文集，2013：178-180.

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Study on the Quality Standard for Mongolian Medicine Yishen Powder

WANG Meili1，HAI Qishan2，DAI Lili1，TIAN Xiang3，BAI Yuxia1（1.College of Mongolian Medicine，Inner Mongolia University for the Nationalities，Inner Mongolia Tongliao 028300，China；2.Tongliao Kezuozhongqi Mongolian Hospital，Inner Mongolia Tongliao 029300，China；3.School of Pharmacy，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard for Mongolian medicine Yishen powder.METHODS：TLC was used for the qualitative identification of Rheum palmatum and Terminalia chebula in the preparation；HPLC was used for the contents determination of aloe emodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcion：the column was Inertsil C18with mobile phase of methanol-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength was 254 nm，column temperature was 35℃ and the injection volume was 10 μL.RESULTS：The TLC pots of R.palmatum and T.chebula were clear and well-separated，negative control without interference.The linear range was 23.55-117.75 ng for aloe emodin（r＝0.999 9），44.72-223.62 ng for rhein（r＝0.999 8），43.18-215.90 ng for emodin（r＝0.999 7），77.41-387.12 ng for chrysophanol（r＝0.999 9）and 46.02-230.10 ng for physcion（r＝0.999 7）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 95.80%-99.66%（RSD＝1.21%，n＝6），95.01%-98.07%（RSD＝0.92%，n＝6），95.06%-97.84%（RSD＝0.5%，n＝6），95.19%-97.66 %（RSD＝1.07%，n＝6）and 95.07%-98.20%（RSD＝0.95%，n＝6）.CONCLUSIONS：The established standard can be used for the quality control of Mongolian medicine Yishen powder.

Mongolian medicine Yishen powder；TLC；HPLC；Content determination

R917；R927

A

1001-0408（2017）06-0823-04

2016-02-23

2016-05-08）

（編輯：張 靜）

通遼市與內蒙古民族大學科技合作項目（No. SXZD2012011）

＊碩士研究生。研究方向：蒙藥及復方制劑質量標準。電話：0475-8314242

#通信作者：教授，碩士生導師，博士。研究方向：蒙藥材及蒙藥制劑質量標準。E-mail：byx6088@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.06.28