辣椒輕斑駁病毒鳳城分離物的鑒定、全基因測序及系統進化分析

竹懷婷, 李曉冬, 侯慧慧, 徐千惠, 安夢楠

(沈陽農業大學植物保護學院, 沈陽 110866)

辣椒輕斑駁病毒鳳城分離物的鑒定、全基因測序及系統進化分析

竹懷婷, 李曉冬, 侯慧慧, 徐千惠, 安夢楠*

(沈陽農業大學植物保護學院, 沈陽 110866)

辣椒輕斑駁病毒Peppermildmottlevirus(PMMoV)屬于煙草花葉病毒屬,是辣椒上重要的病原病毒之一,近年來PMMoV對遼寧部分辣椒產區造成嚴重危害。本文采用DAS-ELISA檢測以及RT-PCR的方法首次從遼寧省鳳城市蔬菜產區辣椒病葉中檢測出PMMoV,暫命名為PMMoV-FC。設計3對特異性引物對其進行擴增并測序后得到該病毒分離物全基因序列。將PMMoV-FC的全基因序列與已報道的國內外9個PMMoV分離物進行同源性分析,結果表明,其同源性介于94.3%～99.7%之間。基于全基因序列的系統發育進化分析表明,PMMoV-FC與國內分離物、日本分離物以及美洲分離物親緣關系密切,而與韓國和西班牙分離物親緣關系稍遠。鑒于該病毒在辣椒上造成的嚴重危害,對于PMMoV-FC在遼寧地區的發生以及防治仍需進行更為詳細的研究。

辣椒輕斑駁病毒; RT-PCR; 全基因組測序; 系統進化分析

我國近年來辣椒Capsicumfrutescens產業發展迅速,已成為世界上辣椒栽培面積最大的國家[1],種植面積基本穩定在150萬～160萬hm2,約占我國蔬菜種植面積的10%[1-2]。辣椒也是我國遼寧省重要的蔬菜作物之一,辣椒病毒病是危害辣椒生產的重要病害,常導致辣椒落葉、落花、落果,可造成減產30%～50%,甚至絕收,成為影響辣椒產量的主要因素之一[3]。辣椒輕斑駁病毒Peppermildmottlevirus(PMMoV)屬于煙草花葉病毒屬Tobamovirus的正義鏈RNA病毒,基因組RNA由6 356或6 357個堿基組成,編碼病毒復制酶蛋白p126和p183、運動蛋白(movement protein, MP)和外殼蛋白(17 kDa)等至少4種蛋白[4-5],是世界范圍內造成辣椒經濟損失的重要病原之一。PMMoV可以通過種子和汁液摩擦傳播,帶毒種子、發病植株和病土是重要的侵染來源[6]。PMMoV最早報道于美國辣椒[7],1994年在中國新疆辣椒上首次發現[8]。2014年6月遼寧省葫蘆島地區溫室大棚辣椒上暴發辣椒輕斑駁病毒病,50%的辣椒受到侵染,受害總面積達15 hm2,直接造成三分之一的經濟損失[9]。感病辣椒葉片呈現斑駁、花葉、扭曲或皺縮,莖稈上出現褐色壞死斑,果實變小畸形、果面斑駁或出現凹陷壞死等明顯病毒病癥狀,后期辣椒果實外觀和內在品質均顯著變差[10]。迄今有關遼寧地區辣椒輕斑駁病毒的基因序列的詳細研究十分缺乏,本研究采用反轉錄PCR(RT-PCR)和雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(DAS-ELISA)檢測等技術對PMMoV鳳城辣椒分離物(PMMoV-FC)的基因全序列進行克隆和序列分析,明確了該分離物與國內外分離物的親緣關系,從分子水平鑒定該病毒分離物,為后續在該病毒的預防和控制方面提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

毒源的采集與保存:本研究于2015年9月在遼寧省鳳城市鳳山區大梨樹村辣椒生產區調查采樣,采集的辣椒(品種為‘津福15號’)病葉具有明顯花葉和斑駁癥狀。將上述癥狀病樣汁液摩擦接種于溫室培養辣椒‘津福15號’上繁殖并保存。

生化及分子生物學試劑:供試PMMoV的DAS-ELISA檢測試劑盒購自美國Agdia公司;植物總RNA提取所用TRIzon Reagent試劑購自北京康為世紀公司;反轉錄TIANScriptcDNA第一鏈合成試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,PCR擴增酶 Ex Taq購自大連寶生物公司;引物由上海生工合成,質粒核酸測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 DAS-ELISA血清學檢測

取田間采集到的辣椒疑似感染病毒病葉,加入PBS緩沖液進行研磨裂解后,采用DAS-ELISA法進行檢測。按照DAS-ELISA試劑盒說明書進行操作,終止液終止反應后用酶標儀于405 nm波長下讀取每孔的吸光度。

1.2.2 辣椒葉片總RNA提取及反轉錄

選取2份發病癥狀明顯的辣椒病葉,以一份溫室培育的健康辣椒葉片作為對照,提取葉片總RNA,每份樣品稱取0.1 g。提取方法按照TRIzon Reagent試劑說明書步驟進行,將得到的葉片總RNA存于-80℃下備用。以提取的總RNA為模板,采用隨機引物,參照TIANScriptcDNA第一鏈合成試劑盒說明書方法獲取反轉錄產物cDNA。

1.2.3 基因全序列的克隆與測序

根據GenBank中PMMoV中國分離物PMMoV-CN(登錄號:AY859497)的基因序列設計3對特異性引物(表1)。引物由上海生工合成。

表1 PMMoV特異性擴增引物

Table 1 Specific primer sequences for PMMoV amplification

引物名稱Primer序列(5'-3')Sequence起始位點InitiationsitePMMoV1FGTAAATTTTTCACAATTTAA-CAACAACAAC1PMMoV1RACACCAAAGATTCGGAGCTC2482PMMoV2FGTAGAGTCGCAGTGAGCTCC2450PMMoV2RTAGCATAGAGGACAGACATGC4466PMMoV3FGAGGAAAAGCGGTGATGTCAC4395PMMoV3RTGGGCCGCTACCCGCGGTTC6356

以葉片的總RNA為模板,采用3步RT-PCR法擴增PMMoV-FC的全基因序列。分別以特異性引物PMMoV1F和PMMoV1R,PMMoV2F和PMMoV2R以及PMMoV3F和PMMoV3R擴增PMMoV-FC(圖1),并進行測序,將測序結果通過拼接得到PMMoV-FC全基因序列。PCR反應體系按照反轉錄試劑盒進行操作,總體積為25 μL,反應條件為94℃ 1 min;94℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 3 min,35個循環;72℃ 8 min。PCR產物分別進行電泳并切膠回收后與pMD19-T載體(寶生物公司)進行連接,轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α(北京康為世紀生物科技有限公司),于含50 ng/μL氨芐青霉素的平板上培養過夜,經藍白斑篩選挑取白色菌落進行培養,提取質粒。將篩選出的含重組質粒的陽性克隆送至金唯智生物科技(北京)有限公司進行測序。采用DNAMAN V8.0(Lynnon Corporation)軟件及BLAST(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行序列分析,利用Clustalx v1.81和Mega v6.06軟件構建系統進化樹。

圖1 RT-PCR擴增過程Fig.1 Amplification process of RT-PCR

2 結果與分析

2.1 辣椒疑似病毒病樣品田間癥狀

調查發現,發病辣椒葉片呈現斑駁、花葉、扭曲或皺縮,莖稈上出現褐色壞死斑,果實變小畸形、果面斑駁或出現凹陷壞死等明顯病毒病癥狀,果實外觀和內在品質均顯著下降(圖2)。

圖2 田間辣椒病葉癥狀Fig.2 Symptoms of diseased pepper leaves in the field

2.2 PMMoV的DAS-ELISA血清學檢測

對采集到的3個病樣進行DAS-ELISA檢測結果表明辣椒病葉均呈PMMoV陽性,其中辣椒病葉PMMoV檢測OD平均值=1.06;陰性對照OD平均值=0.095;PMMoV陽性質控物OD平均值=0.81,表明采集到的樣品中攜帶PMMoV。

2.3 PMMoV-FC RT-PCR擴增結果

分別采用PMMoV1F和PMMoV1R,PMMoV2F和PMMoV2R以及PMMoV3F和 PMMoV3R 3對特異性引物(表1),以反轉錄的cDNA為模板進行了PCR(RT-PCR)擴增(圖1)。瓊脂糖凝膠電泳結果表明:泳帶從左到右分別擴增出長度約為2.5、2和2 kb的單一PCR產物片段(圖3)。

2.4 PMMoV-FC的全基因測序

通過DNAMAN V8.0軟件對3段克隆到pMD19-T載體的PCR擴增產物進行測序和拼接,每段產物至少測通3個克隆以上,確保序列結果的準確性。將拼接后的PMMoV-FC全基因序列上傳至NCBI數據庫并獲得臨時登記號(KU646837)。

圖3 3對特異性引物的 PMMoV-FC RT-PCR擴增產物Fig.3 RT-PCR products of PMMoV-FC using three pairs of specific primers

2.5 PMMoV-FC與其他分離物的基因同源性比對

從GenBank中選取9個PMMoV分離物(其中包括2個中國分離物、4個來自亞洲其他國家的分離物、2個美洲分離物和1個歐洲分離物)和煙草花葉病毒屬其他2種病毒分離物基因全序列,采用DNAMAN軟件對PMMoV-FC的基因全序列與上述基因的序列同源性進行了比較,結果(表2)表明:PMMoV-FC與選取的9個PMMoV分離物核苷酸的序列同源性介于94.4%～99.7%之間,同源性很高,其中與中國分離物PMMoV-CN(AY859497)、PMMoV-HN1(KP345899)和日本分離物PMMoV-J(AB000709)、PMMoV-Jp(AB069853)以及美洲分離物PMMoV BR-DF01(AB550911)、PMMoV-A(NC003630)同源性均在99%以上;與分離物PMMoV-Kr(AB126003)、PMMoV-Ia(AJ308228)、PMMoV-P3(LC082100)的親緣關系相對較遠,同源性介于94.3%～97.3%之間,與TMV(NC001367)相似度為69.5%,與CGMMV(NC001801)的相似度為51.1%(表2)。

2.6 基于全基因序列的PMMoV系統進化樹分析

將PMMoV-FC基因全序列與上述分離物(表2)進行比對后,通過Clustalx V1.81和Mega V6.06構建系統進化樹(圖4)。結果表明:采用Neighbor-Joining聚類分析方法將所有PMMoV分離物聚類在一起,形成兩大支系群體,PMMoV-FC與來自中國、日本、韓國和美洲的6個PMMoV分離物聚為一個支系,與西班牙分離物(PMMoV-Ia)和來自韓國的另一種分離物(PMMoV-P3)分屬不同支系,但親緣關系仍相對較近,與TMV以及CGMMV親緣關系很遠(圖4)。

表2 PMMoV-FC核苷酸序列同源性比較

Table 2 Homology analysis of PMMoV-FC genome sequence with other PMMoV isolates and other virus ofTobamovirus

分離物IsolateGenBank登錄號GenBankaccessionno.來源Origin核苷酸序列同源性/%IdentityPMMoV-JAB000709日本99.7PMMoV-JpAB069583日本99.7PMMoV-CNAY859497中國99.6PMMoV-HN1KP345899湖南99.6PMMoV-ANC003630美國99.6PMMoV-BR-DF01AB550911南美99.3PMMoV-KrAB126003韓國97.3PMMoV-IaAJ308228西班牙94.4PMMoV-P3LC082100韓國94.3TMVNC001367俄羅斯69.5CGMMVNC001801日本51.1

圖4 基于PMMoV基因核酸全序列的系統進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of PMMoV complete genome sequences

3 結論與討論

自向本春等[8]首次將新疆石河子地區辣椒上危害的病毒鑒定為辣椒輕斑駁病毒以來,近些年在我國華北地區、山東青島、西南貴州、西北寧夏、陜西乃至臺灣地區的辣椒上均發現該病毒[11-13],可見其危害地區越來越廣、危害面積也在逐步增加。遼寧省辣椒主栽品種有‘丹椒4號’、‘超級金塔2號F1’、‘西星牛角椒1號’、‘津福15號’、‘益都紅’、‘辣優8號’、‘鞍椒1號’、‘猛椒3號’等。本研究通過RT-PCR檢測,可確定遼寧省丹東市鳳城大梨樹村采集到辣椒病葉為PMMoV所致,帶毒樣品為‘津福15號’,在遼寧地區屬于主栽品種之一,具有代表性。本研究通過同源性分析以及系統進化樹分析明確PMMoV-FC與GenBank中9個國內和其他國家PMMoV分離物同源性很高,核苷酸同源性介于94.3%～99.7%之間。采用聚類分析法構建系統發育進化樹并明確了該分離物與國內分離物、日本分離物以及美洲分離物親緣關系密切,而與韓國和西班牙分離物親緣關系稍遠。通過上述結果揭示PMMoV-FC可能與中國已報道的幾種分離物,日本以及美洲分離物具有相同的進化祖先。

近年,隨著國際間種子、苗木貿易往來日益頻繁,各口岸出入境檢疫部門不僅在引種種植的辣椒上檢測到PMMoV,也從我國臺灣及韓國等進境辣椒種子中檢測到PMMoV的存在。Peng等[14]通過對不同省份的42份市場上銷售的辣椒醬進行檢測,結果表明:辣椒醬中的PMMoV仍具有侵染活性,PMMoV也會隨著辣椒醬等辣椒制品的貿易進行傳播。同時,Colson等[15]的研究表明食用含有PMMoV的辣椒產品可導致腹瀉,發熱等癥狀。因此,應重視PMMoV對于辣椒生產上的危害以及對人們健康方面的潛在威脅。但PMMoV尚不屬于我國禁止進境的檢疫性有害生物,無法通過植物檢疫措施阻止該病毒進入我國。PMMoV在遼寧的發生尚不普遍,除葫蘆島市和鳳城市以外,暫未在其他地區檢測到PMMoV,鑒于其潛在的危害性,對于該病毒的發生以及防控仍需進行更加深入的研究。

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(責任編輯：田 喆)

Identification, whole-genome sequencing and phylogenetic analysis ofPeppermildmottlevirusFengcheng isolate

Zhu Huaiting, Li Xiaodong, Hou Huihui, Xu Qianhui, An Mengnan

(CollegeofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China)

Peppermildmottlevirus(PMMoV), a member ofTobamovirus, is a major viral pathogen of pepper. In recent years, PMMoV has caused great loss to pepper production in Liaoning Province. In this study, PMMoV was first identified in Fengcheng City by using DAS-ELISA and RT-PCR method, and named as PMMoV Fengcheng isolate (PMMoV-FC). Three pairs of specific primers were used to amplify the complete genome sequence of PMMoV-FC, and the results of sequence analysis and phylogenetic analysis showed that PMMoV-FC was closely related with 9 PMMoV isolates reported in China or abroad with a sequence identity of between 94.3%-99.7%. Phylogenetic tree was constructed, showing that PMMoV-FC was closely related with Chinese domestic isolate, Japanese isolate and southern American isolate but not with South Korean isolate or Spanish isolate. Due to the significant losses caused by PMMoV to pepper, further research is required to control and prevent the prevailing of the diseases caused by PMMoV-FC in Liaoning Province.

PMMoV; RT-PCR; whole-genome sequencing; phylogenetic analysis

2016-05-09

2016-06-15

公益性行業(農業)科研專項(201303028);沈陽農業大學2016大學生創新訓練計劃項目

S 436.418

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.009

* 通信作者 E-mail:anmengnan1984@163.com