一株豬源B型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定

■文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友

一株豬源B型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定

■文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友

對山東惠民某豬場豬病料進行病原菌的分離，對分離菌進行形態學觀察、生化試驗、藥敏試驗、致病性試驗和PCR鑒定。結果成功分離到一株莢膜血清B型多殺性巴氏桿菌，該菌的分離鑒定為自家滅活菌苗的制備提供了候選菌株。

多殺性巴氏桿菌；莢膜血清B型；分離鑒定

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)是一種重要的病原菌，對多種動物和人均有致病性。Pm可引起豬巴氏桿菌病(Swine pasteurellosis)，該病又叫豬肺疫，俗稱“鎖喉風”或“腫脖子瘟”。急性病例為出血性敗血病、咽喉炎和肺炎的病狀，慢性病例主要為慢性肺炎癥狀，散發性發生，給養豬業造成嚴重的經濟損失[1]。Pm分為A、B、D、E和F等5個莢膜血清型[2]，其中B型是導致我國豬巴氏桿菌病的主要病原[3,4]。Townsend等[5]建立了多殺性巴氏桿菌PCR鑒別和分型方法，已得到國內研究者的廣泛應用[6,7]。2016年8月山東省惠民某豬場，豬呼吸困難、咳嗽、食欲廢絕、腹瀉，開始個別死亡，然后病情迅速蔓延，出現大量死亡。剖檢可見鼻腔有膿性分泌物，咽喉部黏膜充血、水腫；支氣管、氣管出血，內有多量泡沫狀粘液；內臟器官廣泛出血，胸腔、心包內有大量積液，肺臟與胸壁粘連，充血、水腫并伴有不同程度的實變，肝腫大、有小壞死灶，胃、腸黏膜出血，淋巴結水腫。本試驗采集病死豬的心血、肝臟、脾臟等病料，對采集病料進行細菌分離培養、形態學觀察、生化試驗、藥敏試驗、致病性試驗及PCR鑒定，確定此分離株是豬源B型多殺性巴氏桿菌。

1 材料

1.1 病料

對山東省惠民某豬場疑似巴氏桿菌病死豬進行剖檢，無菌采取心血、肝臟、脾臟等病料。

1.2 試驗用動物

20只16～20g清潔級昆明系小鼠，購自山東省實驗動物中心。

1.3 試劑

草酸銨結晶紫、革蘭氏碘液、石炭酸復紅染液、普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板及血清肉湯培養均由山東綠都生物科技有限公司質量監察部提供；生化試驗用各種試劑及糖發酵管、藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司；DL2000 Marker、Taq酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；基因組DNA小量抽提試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司。

1.4 PCR引物設計

參照文獻[5]設計豬多殺性巴氏桿菌PCR鑒定和分型引物，鑒定引物用于擴增KMT1基因片段，擴增片段長度為460bp，分型引物分別用于擴增A、B、D、E、F莢膜血清型特異性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD，擴增片段長度分別為1,044bp、760bp、657bp、511bp和851bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物信息

表2 分離菌的生化反應結果

2 方法

2.1 直接涂片鏡檢

在無菌條件下，分別將無菌采取病死豬的心血、肝臟、脾臟涂片或觸片，干燥、固定、革蘭氏染色、鏡檢，觀察其形態特征。

2.2 細菌分離培養

將采集的豬心血、肝臟、脾臟無菌劃線接種于血液瓊脂平板，37℃培養24h，觀察生長情況，對可疑菌落進行涂片，革蘭氏染色鏡檢[8]。挑取單個可疑菌落接種于麥康凱營養瓊脂培養基上，37℃培養24h。

2.3 生化鑒定

分別將分離菌經24h鮮血瓊脂平板純培養后，進行糖發酵試驗及其他生化試驗。

2.4 藥敏試驗

采用紙片瓊脂擴散法(K-B法)將所分離的巴氏桿菌24h血清肉湯純培養物10倍稀釋后，接種于鮮血瓊脂平板上，每個平板接種0.2mL，并將其涂布均勻。然后用無菌鑷子將各種藥敏片分別平放在培養基表面，保持紙片間適度距離，37℃溫箱24h。觀察結果并測量抑菌圈直徑。

2.5 致病性試驗

20只小白鼠，隨機分兩組，每組10只。無菌吸取上述經生化鑒定的分離菌培養物，腹腔分別注射10只試驗組小白鼠，每只注射0.2mL(2×109CFU/mL)，10只對照分別腹腔注射0.2mL血清肉湯作對照。注射后小白鼠隔離飼養，觀察發病及死亡情況。并對死亡小白鼠的心血、腦、脾進行細菌分離。

2.6 PCR鑒定及分型

挑取血液瓊脂平板上單個菌落，接種于含5%小豬血清的馬丁液體培養基中，37℃ 200rpm，振蕩培養20h，用基因組DNA小量抽提試劑盒(上海華舜生物技術有限公司)提取分離菌株的基因組DNA作為PCR的模板，進行PCR擴增。反應體系(50μL)：10×Buffer(含MgCl2)5μL、上下游引物各2μL(20pmol/L)、dNTP 4μL、TagDNA聚合酶0.5μL、模板1μL，加水補足至50μL。擴增反應程序：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，30個循環；72℃ 7min。分型采用多重PCR，反應體系與條件同上。取5μL PCR產物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產物回收，連接到pMD18-T載體，轉化大腸桿菌感受態DH5a，挑取單菌落，搖床培養，將鑒定陽性的質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

3 結果與分析

3.1 直接涂片鏡檢結果

心血涂片肝臟、脾臟觸片革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陰性短小桿菌，瑞氏染色成典型的兩極著色。

表3 分離菌株的藥物敏感性試驗結果

圖1 分離菌株的PCR鑒定

圖2 分離菌株的PCR分型

圖3 測序結果

3.2 細菌分離培養結果

在鮮血瓊脂平板上37℃培養24h后，形成表面光滑濕潤、圓形隆起、邊緣整齊、微藍色閃光的菌落，菌落周圍不溶血。挑取單個菌落涂片進行革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性短小桿菌，瑞氏染色成典型的兩極著色。在麥康凱營養瓊脂培養基上未見生長。

3.3 生化試驗結果

由表2可知，從病死豬中分離的巴氏桿菌能發酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、山梨醇，不能發酵肌醇、水楊苷、鼠李糖、衛矛醇、麥芽糖、菊糖、棉籽糖、乳糖，靛基質試驗陽性，V-P試驗陰性，與巴氏桿菌的生化特征一致。

3.4 藥物敏感性試驗結果

由表3可知，分離菌對頭孢曲松、氟苯尼考、左氧氟沙星高度敏感，對氨芐西林、萬古霉素、多粘菌素B、慶大霉素、阿米卡星低度敏感，對阿奇霉素、羅紅霉素、四環素、新霉素、磷霉素、復方新諾明耐藥。

3.5 致病性試驗

分離菌的血清肉湯純培養物注射試驗組的小白鼠24h后，均表現精神沉郁、活動減弱、呼吸急促、采食減少，對照組無此現象。試驗組小鼠在接種72h內全部死亡。剖檢死亡小鼠可見胸腔有漿液性纖維素性滲出物，心外膜有出血點，肺出血、壞死。取肺組織涂片，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性短小桿菌。對照組小白鼠未見異常。

3.6 PCR鑒定及分型

采用鑒定引物對分離菌進行PCR檢測，結果顯示，在460bp處有一特異性條帶(見圖1)，說明分離到的菌為多殺性巴氏桿菌，用5對分型引物混合進行多重PCR，結果顯示該分離菌株在760bp左右有一條特異性條帶(見圖2)，說明所分離到的病原菌為豬B型多殺性巴氏桿菌。

3.7 基因克隆的測序分析

目的基因回收后，連pMD18-T載體，轉化DH5a，采用PCR方法篩選陽性菌落，同時將含有插入片段的陽性質粒送去測序。測序結果見圖3，將測得序列與GenBank中的進行同源性比較，與巴氏桿菌B型序列(登錄號AF169324)同源性為100%。

4 討論

本試驗對山東惠民豬場病料進行細菌分離，以表型特征為依據初步鑒定為Pm，采用常規的鑒定方法如生化試驗、藥敏試驗和動物致病性試驗進行鑒定，并參照Townsend等[5]建立了多殺性巴氏桿菌鑒定和分型方法，對分離菌進行分子水平的鑒定，表明分離菌為多莢膜B型多殺性巴氏桿菌，PCR方法極大地縮短了從病原上診斷該病的時間，從而為豬多殺性巴氏桿菌病的快速診斷提供了有力的工具。生化試驗結果表明，該分離菌生化特征與巴氏桿菌的一致，可發酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、山梨醇，不能發酵肌醇、水楊苷、鼠李糖、衛矛醇、麥芽糖、菊糖、棉籽糖、乳糖，靛基質試驗陽性，V-P試驗陰性，藥敏試驗結果表明，該分離株對頭孢曲松、氟苯尼考、左氧氟沙星高度敏感，對氨芐西林、萬古霉素、多粘菌素B、慶大霉素、阿米卡星低度敏感，對阿奇霉素、羅紅霉素、四環素、新霉素、磷霉素、復方新諾明有明顯耐藥性。建議豬場在防治巴氏桿菌病時，對分離病源菌進行藥敏試驗，找到最有效的藥物，用2～3種敏感藥物交替使用，才能收到事半功倍的效果。動物回歸試驗表明，小白鼠致死后，再次分離細菌仍然為莢膜血清B型多殺性巴氏桿菌，表明該菌株具有較強的毒力。該菌的成功分離鑒定，為臨床診斷和治療提供可靠依據，為進一步開展巴氏桿菌的分子生物學研究、診斷試劑研制以及自家滅活菌苗的制備等方面的研究奠定了基礎。■

[1] 徐引弟,王治方,朱文豪,等.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定和藥敏試驗[J].中國獸藥雜志,2011,45(5):5～7.

[2] Carter GR. Pasteurellosis:Pasteurella multocida and Pasteurella hemolytica[J]. Adv Vet Sci, 1967,11:321～379.

[3] 吳范庚.我國多殺性巴氏桿菌血清學鑒定及交互免疫試驗[J].中國獸醫雜志,1997,23(8):14～15.

[4] 郭大和,鄭明,潘松年.我國多殺性巴氏桿菌莢膜抗原的血清學鑒定[J].畜牧獸醫學報,1979,10(2):67～77.

[5] Townsend KM, Boyce JD, Chung JY, et al. Genetic organization of Pasteurella multocida cap Loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J]. J Clin Microbiol,2001,39(3):924～929.

[6] 馬文戈,于力.豬源莢膜血清B型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定[J].中國預防獸醫學報,2008,30(10):747～754.

[7] 李永明,羅阿東,徐景峨,等.豬源多殺性巴氏桿菌的生物學鑒定與莢膜PCR分型[J].中國預防獸醫學報,2007,29(7):506～509.

[8] 胡桂學.獸醫微生物實驗教程[M].北京:中國農業大學出版社,2006:35～38.

山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目(SDAIT-08-17)。