熱激處理對草菇耐冷性的影響及對hsp90基因的誘導

黃金麗，趙 妍，辛苗苗，宋曉霞，陳明杰*

（1上海海洋大學食品學院，上海 201306；2上海市農業科學院食用菌研究所，上海市農業遺傳育種重點開放實驗室，農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，上海 201403）

熱激處理對草菇耐冷性的影響及對hsp90基因的誘導

黃金麗1，2，趙 妍2*，辛苗苗2，宋曉霞2，陳明杰1，2*

（1上海海洋大學食品學院，上海 201306；2上海市農業科學院食用菌研究所，上海市農業遺傳育種重點開放實驗室，農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，上海 201403）

熱激蛋白是生物體抵御逆境脅迫的重要蛋白，高溫脅迫是誘導熱激蛋白產生的重要因素，其中hsp90基因可以在高溫誘導時大量產生。以草菇菌株V23和VH3為試驗材料，首先觀察了熱激處理對低溫脅迫后草菇菌絲恢復生長情況的影響，然后測定了經過熱激處理再進行低溫脅迫后草菇hsp90基因的表達量變化。研究結果顯示：熱激處理顯著提高了V23與VH3的恢復生長速度，增加了草菇菌絲體中hsp90基因的表達量，有助于增強草菇對低溫脅迫的耐受性。

草菇；熱激；低溫脅迫；hsp90；實時熒光定量PCR

草菇［Volvɑriellɑvolvɑceɑ（Bull.）Singer］是一種原產于中國熱帶、亞熱帶地區的美味食用菌，隸屬于擔子菌綱、傘菌目、光柄菇科、小包腳菇屬，其菌絲體的最適生長溫度為32—35℃［1］。由于草菇屬高溫菇種，其菌絲體或子實體在常規0—4℃的冷藏條件下便會出現低溫自溶現象，表現為組織變軟、液化、腐爛等［2］。草菇這種不耐低溫的特性，嚴重影響了其菌種的低溫保藏、子實體的采后貯藏與運輸，阻礙了草菇產業的快速發展，因此對草菇低溫應答機制的研究及其不耐低溫特性的改良成為學者們十分關注的課題。

生物體在比正常生長溫度高5℃以上的環境下生長時（即熱激條件），大部分正常蛋白質的合成被抑制，而分子量8—110 kD的熱激蛋白（Heat shock protein，Hsp）迅速地被誘導合成［3］。在真核生物中，根據熱激蛋白分子量的大小可將其分為5個家族：smHsp（小分子量熱激蛋白，15—30 kD）、Hsp60（約60 kD）、Hsp70（約70 kD）、Hsp90（約90 kD）、Hsp100（大于100 kD）［4］。按照熱激蛋白的類型又可將其分為誘導型和組成型兩類：誘導型Hsp主要在受到外界環境的刺激下被誘導表達，具有保護細胞的功能；組成型Hsp在正常生理狀態下表達，與細胞的分化、發育密切相關。研究表明，真菌中Hsp的誘導合成有助于提高其耐熱性［5-7］，如Lindquist等［5］發現細胞內大量表達的Hsp104對釀酒酵母（Sɑcchɑromyces cerevisiɑe）的耐熱性大幅度提高具有積極作用；金承濤等［6］通過研究認為，釀酒酵母耐熱菌株HU-TY-1的強耐熱性與Hsp72和Hsp84的組成性合成密切相關；李翠翠［7］的研究結果表明，真姬菇（Hypsizygusmɑrmoreus）Hsp70蛋白的異源表達，可顯著提高大腸桿菌（Escherichiɑcoli）耐高溫的能力。但是目前關于熱激誘導真菌Hsp合成提高其抗冷性的研究尚未見報道，此類研究在植物中已取得階段性的進展：如宮偉娜［8］的試驗結果顯示，紫莖澤蘭（Agerɑtinɑɑdenophorɑ）的4個熱激蛋白基因hsp17.6、hsp 60、hsp70及hsp 90在其幼苗莖、葉中的表達都受到熱激的誘導，并且熱激處理后紫莖澤蘭對低溫脅迫的抗性明顯增強；Collins等［9］的研究指出，綠豆（Vignɑrɑdiɑtɑ）下胚軸經40℃熱激處理3 h后誘導合成了9種Hsp，其中有兩個蛋白（70 kD和79 kD）與熱激誘導抗冷性增強有關，可減輕后續的冷脅迫（2.5℃）對細胞膜的損傷，并能有效降低電解質的滲漏；Lafuente等［10］將黃瓜（Cucumis sɑtivus）子葉置于37℃或42℃處理6 h誘導產生了5個Hsp，分子量分別為25 kD、38 kD、50 kD、70 kD和80 kD，這些Hsp的出現與其抗冷性的增強表現一致。

本試驗在草菇全基因組測序的基礎上，選取菌株V23和VH3為試驗材料，擬研究熱激處理對草菇耐冷性的影響，利用實時熒光定量PCR技術，比較了熱激誘導后再進行低溫處理不同時間的草菇菌絲體中hsp90基因表達量的變化情況，為深入開展草菇不耐低溫特性的改良工作奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與試劑

供試草菇菌株V23和VH3均由上海市農業科學院食用菌研究所菌種保藏中心提供。

馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基購自碧迪醫療器械（上海）有限公司；Redzol試劑盒購自北京賽百盛生物技術有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TɑqTMⅡ購自TaKaRa公司；PCR產物純化試劑盒、質粒小量制備試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；大腸桿菌感受態細胞Top10購自天根生化科技有限公司；AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit購自愛思進生物技術（杭州）有限公司；pGEM?-T Easy Vector System I、Tɑq DNA Polymerase in Storage Buffer B購自Promega公司；氯仿、異丙醇、乙醇等購自國藥集團化學試劑有限公司；所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 熱激處理再進行低溫脅迫后草菇菌絲恢復生長速度測定

在長滿草菇菌絲的培養皿上均勻打孔，然后將菌塊接種到新培養基的中央，靜置于32℃培養箱內培養34 h，在菌絲長勢均勻的地方進行第1次劃線。劃線后對培養皿進行40℃2 h的熱激處理，然后再放在冰浴中處理2 h。將冰浴處理后的培養皿放在32℃繼續培養，恢復生長24 h后進行第2次劃線，記錄并計算草菇菌絲的恢復生長速度。

1.3 熱激處理再進行低溫脅迫后草菇hsp90基因的熒光定量分析

1.3.1 草菇菌絲的處理與樣品收集

將固體培養的V23和VH3菌絲用勻漿器打碎后接入到液體培養基中，置于32℃搖床中恒溫培養4 d。將兩菌株先進行40℃2 h的熱激處理，然后放在0℃下分別處理0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h。采用滅菌的無紡布過濾，待無菌水沖洗后用滅菌濾紙吸干水分，將收集的菌絲放入液氮中迅速冷凍，并置于－80℃冰箱中保存備用。

1.3.2 草菇菌絲總RNA的提取與反轉錄

依照Redzol試劑盒說明書提取草菇菌絲的總RNA，并用DEPC預處理的水溶解，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。采用PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser試劑盒，去除基因組DNA，并將其反轉錄為cDNA，置于－20℃保存備用。

1.3.3 目的片段的獲取與標準品質粒的構建

在草菇全基因組序列信息中進行Blast搜索，獲得hsp90基因的1 821個核苷酸編碼區序列，并設計特異性引物（表1），交由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以微管蛋白（Tubulin，Tub）基因作為內參基因，采用常規PCR擴增tub和hsp90基因片段。將合成的基因片段連接到T載體上，導入大腸桿菌中，構建real-time PCR試驗的標準品質粒，質粒測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 實時熒光定量PCR擴增引物Table 1 Prim ers used for real-tim e PCR

1.3.4 hsp90基因的熒光定量分析

將含有內參基因和目的基因的標準品質粒進行10倍稀釋，依次獲得5個梯度的標準品質粒溶液，然后在StepOne Plus熒光定量PCR儀上擴增，構建出標準曲線，并將所得數據按ΔΔCT法計算hsp90基因的相對表達量。實時熒光定量PCR的反應體系如表2所示，反應條件為：95℃預變性20 s，1個循環；95℃5 s，60℃15 s，72℃15 s，該過程進行40個循環。每組樣品設置4個平行樣品孔，并設置無菌ddH2O代替模板作為陰性對照。

表2 RT-PCR反應體系Table 2 Reaction system of real-time PCR

2 結果與分析

2.1 熱激處理再進行低溫脅迫后草菇菌絲恢復生長情況

經過熱激處理再進行低溫脅迫后草菇V23、VH3菌絲的恢復生長情況如圖1所示，熱激處理顯著提高了草菇菌株低溫脅迫后的恢復生長速度。與各自未進行40℃2 h熱激處理的對照相比，經過熱激處理的V23菌株恢復生長速度提高了26.2%，這種優勢在VH3菌株中表現更為明顯，經過熱激處理的VH3菌株恢復生長速度提高了50.6%。

圖1 熱激處理再進行低溫脅迫后草菇V23、VH3菌絲的恢復生長情況Fig.1 Recovery rate of V23 and VH3 strains growing for 24 h after being treated at 40℃for 2 h first and then at 0℃for 2 h

2.2 熱激處理再進行低溫脅迫后草菇hsp90基因的表達量變化

草菇hsp90基因擴增后的熔解曲線出現單一峰值（圖2），表明hsp90基因擴增具有特異性，其相對定量的結果可信。低溫脅迫下草菇V23、VH3的hsp90基因和tub基因經real-time PCR后得到CT值，然后采用ΔΔCT法計算hsp90基因的相對表達量（表3、表4），并比較了熱激處理對草菇菌株耐低溫性的影響。

2.2.1 熱激處理再進行低溫脅迫后V23菌株的hsp90基因表達量變化

由圖3可知，未經40℃熱激處理的草菇菌株V23在低溫脅迫2 h時，hsp90基因相對表達量顯著升高，約為對照組（V23，0 h）的1.76倍；低溫脅迫4 h時，其相對表達量下降，僅為對照組（V23，0 h）的0.95倍；低溫脅迫6 h時，其相對表達量回升至對照組（V23，0 h）的1.66倍；低溫脅迫8 h、10 h時，其相對表達量連續下降。經40℃熱激處理2 h后，草菇菌株V23的hsp90基因受到誘導大量表達，達到對照組（V23，0 h）的2.48倍；低溫脅迫2 h時，hsp90基因相對表達量繼續上升，是對照組（V23，0 h）的2.67倍；低溫脅迫4 h時，其相對表達量顯著降低，僅為對照組（V23，0 h）的0.87倍；低溫脅迫6—10 h時，其相對表達量有所回升且較為穩定。經過40℃2 h熱激處理后再進行低溫脅迫與之前只受到低溫脅迫相比，V23的hsp90基因相對表達量在低溫脅迫前6 h內，其變化趨勢基本一致，均呈現先上升后下降再上升的趨勢；但在低溫脅迫的0 h、2 h、8 h、10 h時，經40℃2 h熱激的V23菌絲體中hsp90基因的相對表達量要顯著高于未經熱激處理的，表明熱激處理有效提高了V23菌絲體中hsp90基因的相對表達量，有助于增強V23對低溫脅迫的耐受能力。

圖2 hsp90基因的熔解曲線Fig.2 M elt curve of hsp90 gene

圖3 低溫處理不同時間下V23和40℃2 h V23中hsp90基因的表達量變化Fig.3 Relative expression of hsp90 gene during low tem perature process in m ycelia of V23 and 40℃2 h V23

表3 低溫處理下草菇V23菌絲中hsp90基因的相對表達量Table 3 Relative expression of hsp90 gene under low tem perature stress in mycelia of V23

表4 低溫處理下草菇VH3菌絲中hsp90基因的相對表達量Table 4 Relative expression of hsp90 gene under low temperature stress in m ycelia of VH3

2.2.2 熱激處理再進行低溫脅迫后VH3菌株的hsp90基因表達量變化

未經40℃熱激處理的草菇菌株VH3在低溫脅迫2 h時，其hsp90基因相對表達量明顯上升，為對照組（VH3，0 h）的1.81倍（圖4）；之后的低溫脅迫4—8 h期間，其相對表達量逐漸降低；到低溫脅迫10 h時，其相對表達量有所回升，達到對照組（VH3，0 h）的1.33倍。經40℃熱激處理2 h后，在低溫脅迫2 h、4 h時，草菇菌株VH3的hsp90基因相對表達量顯著升高，分別達到對照組（VH3，0 h）的1.42倍和1.76倍；在隨后的低溫脅迫期間，hsp90基因的相對表達量逐漸降低。經過40℃2 h熱激處理后再進行低溫脅迫與之前只受到低溫脅迫相比，VH3的hsp90基因的相對表達量變化趨勢基本一致，均呈現出先升高再降低的趨勢；但在低溫脅迫4—8 h期間，經40℃2 h熱激的VH3菌絲體中hsp90基因的相對表達量要顯著高于未經熱激處理的，表明熱激處理增加了VH3菌絲體中hsp90基因的轉錄表達量，在一定程度上改善了VH3抵御低溫脅迫的能力。

圖4 低溫處理不同時間下VH3和40℃2 h VH3中hsp90基因的表達量變化Fig.4 Relative expression of hsp90 gene during low tem perature process in m ycelia of VH3 and 40℃2 h VH3

3 結論與討論

Hsp90是真核生物細胞質中表達量最豐富的蛋白質之一，在細胞的基本代謝活動中具有重要的作用［11-12］。Hsp90是一種受ATP調節的二聚體分子伴侶，結構較為保守，存在3個主要的結構域，即N端高度保守的ATPase結構域、中間結構域和介導Hsp90二聚化的C端結構域，在與底物蛋白的相互作用中這3個結構域均有參與［13］。在正常生理狀態下，Hsp90以同源二聚體形式存在，細胞蛋白的折疊也并不需要Hsp90的參與；在逆境脅迫條件下，包括hsp90在內的很多熱激蛋白基因大量瞬時表達［14-15］，促使損傷蛋白進行修復。熱激蛋白基因的表達受熱激因子（Heat Shock Factor，HSF）調控，而位于hsp基因啟動子上的熱激元件（Heat Shock Element，HSE）是HSF的結合位點。在正常生理條件下，HSF以單體形式與Hsp90二聚體相結合；在脅迫環境下，Hsp與HSF分離去處理變形蛋白，激活的HSF結構發生變化，轉化為三聚體形式緊密結合于HSE元件上，從而啟動誘導hsp基因的轉錄［16-17］。研究表明，植物hsp90的轉錄表達受各種逆境脅迫的誘導。在受到熱、鹽和重金屬脅迫后，擬南芥（Arɑbidopsis thɑliɑnɑ）的hsp90基因表達量顯著增加［18-19］；水稻（Oryzɑsɑtivɑ）的hsp90基因在受到鹽、干旱、低溫和ABA的誘導后也出現大量積累［20］。

本研究首先觀察了熱激處理對低溫脅迫后草菇菌絲恢復生長情況的影響，發現經過40℃2 h熱激處理后再進行低溫脅迫與之前只受到低溫脅迫相比，熱激處理顯著提高了草菇菌株V23與VH3的恢復生長速度，分別較各自的對照增加了26.2%和50.6%。隨后，對熱激處理再進行低溫脅迫后草菇hsp90基因的表達量變化進行了分析，結果顯示：在低溫脅迫的0 h、2 h、8 h、10 h時，經40℃2 h熱激的V23菌絲體中hsp90基因的相對表達量要顯著高于未經熱激處理的；同樣在低溫脅迫4—8 h期間，經40℃2 h熱激的VH3菌絲體中hsp90基因的相對表達量也要顯著高于未經熱激處理的。這些研究結果表明，熱激處理誘導了草菇菌絲體中hsp90基因的大量表達，有助于增強草菇對低溫脅迫的抵御能力，這與在植物中的相關研究結果相一致。因此，本研究表明熱激處理能夠增加hsp90基因的表達量，有助于提高草菇的耐低溫能力，但其具體作用機制還有待于進一步探討。

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（責任編輯：張睿）

Effect of heat treatm ent on adaptation of Volvariella volvacea to low temperature stress and on relative expression of hsp90 gene

HUANG Jin-li1，2，ZHAO Yan2*，XIN Miao-miao2，SONG Xiao-xia2，CHEN Ming-jie1，2*
（1College of Food Science＆Technology，Shɑnghɑi Oceɑn University，Shɑnghɑi201306，Chinɑ；2Institute of Edible Fungi，Shɑnghɑi Acɑdemy of Agriculturɑl Sciences；Shɑnghɑi Key Lɑborɑtory of Agriculturɑl Genetics ɑnd Breeding；Key Lɑborɑtory of Edible Fungi Resourcesɑnd Utilizɑtion（South），Ministry of Agriculture，P.R.Chinɑ；Nɑtionɑl Engineering Reseɑrch Center of Edible Fungi，Shɑnghɑi201403，Chinɑ）

Heat shock proteins（HSPs）protect against cellular damage caused by environmental stress. Hsp90 is one of the HSPs，which are often induced by heat treatment.This experimentwas conducted with the mycelia of two Volvɑriellɑvolvɑceɑstrains V23 and VH3.The effect of heat treatment on recovery rate of the two strains growing for 24 h was observed.Relative expression of hsp90 gene under low temperature stress inmycelia of V23 and VH3 after being treated at40℃for 2 h was alsomeasured.The results showed that heat treatment speeded up the recovery rate of V23 and VH3 and increased the relative expression of hsp90 gene under low temperature stress.All these results suggested that heat treatment could be helpful for the adaptation of V. volvɑceɑto low temperature stress.

Volvɑriellɑvolvɑceɑ；Heat treatment；Low temperature stress；hsp90；Real-time PCR

S646.13

A

1000-3924（2017）01-015-06

2016-04-11

上海市科技興農重點攻關項目應用基礎類（滬農科攻字2014第7-1-5號）；國家自然科學基金項目（31301828）作者簡介：黃金麗（1989—），女，碩士，研究方向：食用菌功能基因

*通信作者，趙妍（1981—），女，博士，副研究員，研究方向：食用菌功能基因與生理生化。E-mail：jiandan289＠126.com

陳明杰（1965—），男，博士，研究員，研究方向：食用菌遺傳育種與生理生化。E-mail：mjchen＠saas.sh.cn