不同溫度下銀耳生理變化規律與出耳農藝性狀分析

張海洋，林 輝，王長文，張琪輝，鄭 峻，孫淑靜，4，胡開輝，4，鐘冬季

（1.福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002；2. 古田縣食用菌研發中心，福建 古田 352200；3.福建省食用菌技術推廣總站，福建 福州 350002；4.福建農林大學（古田）菌業研究院，福建 古田 352200；5.古田縣恒春農業開發有限公司，福建 古田 352200）

銀耳（Tremella fuciformis）為中國特產，別名白木耳、白耳子、川耳等，質量上乘者稱為雪耳，以其形似人耳、色如銀而得名，是一種經濟價值很高、在我國醫學中久負盛名的食藥兩用真菌，素有“菌中之冠”的美譽［1-3］。銀耳在我國已有130多年的栽培歷史［4］，隨著國家對食用菌產業的支持，銀耳栽培已有了長足的進步，但是由于缺乏相關的科研技術與科研人員，目前銀耳生產模式主要還是采用傳統的家庭小作坊式生產，生產管理者主要靠經驗，對銀耳生產過程中關鍵的影響因素如溫度、濕度、光照、氧氣等沒有系統而準確的認識。小作坊生產無法準確調控環境如溫度、濕度，必須依靠季節來生產，一旦天氣反常，會造成減產，帶來巨大的經濟損失。因此工廠化生產將成為必然趨勢，目前古田正處在轉型階段，已有少數幾家進行工廠自動化栽培的公司。工廠化生產的優點表現在可以控溫控濕，一年不停歇進行生產，不再受季節影響，這樣不僅能夠帶來更多的產量，而且經濟利潤也增加。溫度和濕度在銀耳整個生產過程中都是關鍵因素，對菌絲的理化參數影響較大，對銀耳的產量與品質都起著關鍵的作用。分析理化參數的變化可以更好的掌握菌絲對栽培料基質的利用情況，從而能夠合理的調整栽培料的配比。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀耳菌種Tr01由古田珍稀食用菌研究所提供。供試菌包（對折55 cm×13 cm）由古田建宏農業開發有限公司提供。

菌包培養基（栽培料）配方：棉籽殼84%，麩皮15%，石膏粉1.5%（含水量55%～60%）。機械化混勻栽培料，分裝栽培袋、打空穴，用膠布貼封空穴制成菌包，105～108℃滅菌12 h。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌包培養 無菌條件下，使用銀耳接種器通過菌包上的空穴將銀耳菌種接種到栽培料中，接種后分別放入20、24、28℃恒溫生化培養箱進行避光培養。每隔5 d測定菌袋的變化情況（其中菌包培養20 d，20～30 d為出耳階段）。

1.2.2 樣品前處理 在整個菌絲生長過程中（從接種后開始），每隔5 d，取出3袋栽培料作為重復試驗樣品，分別切取以中間的接種穴為中心的6 cm寬的培養料放入不銹鋼盆中用手充分揉捻均勻，充分混勻后，準確稱取20 g培養料用于制備粗酶液，另取10 g栽培料置于60℃烘干至恒重，用于測定含水量與總糖含量。

1.2.3 粗酶液的制備 將稱取好的20 g栽培料，在三角瓶中按照料水比1∶5加入ddH2O于25℃、150 r/min恒溫振蕩搖床充分浸提90 min，取出三角瓶使用雙層紗布進行過濾，過濾完成后置于50 mL離心管，9 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液，用于測定pH值等生理生化指標。

1.2.4 總糖及蛋白含量測定 總糖含量參照肉品總糖含量測定的國家標準［5］進行測定，還原糖含量參照薛丹等［6］的方法進行測定，可溶性蛋白含量參照牛建峰等［7］的方法進行測定。

1.2.5 酶活力測定 （1）羧甲基纖維素酶活力：參照趙玉萍等［8］的方法稍作改動，反應體系3 mL：在試管中加入1 mL 1% CMC-Na溶液、0.5 mL粗酶液（對照滅活），50℃保溫30 min，后加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴7 min顯色，然后用冷流水冷卻終止反應，用蒸餾水定容至10 mL，于540 nm處測量吸光度。

（2）淀粉酶活力：參照孫靜等［9］的方法稍作改動，吸取4 mL可溶性淀粉溶液于試管中，置于60℃恒溫水浴中預熱5 min。加入pH 6.0磷酸緩沖液1 mL、粗酶液500 μL（對照滅活），立即計時反應30 min。立即吸取反應液1 mL，加入盛有0.5 mL稀鹽酸和5 mL稀碘液的試管中，在660 nm處測定吸光度。

（3）中性蛋白酶活力：參考蛋白酶活力測定的國家標準［10］進行測定。

（4）漆酶活力：參考郭艷艷等［11］的方法，采用ABTS法測定。

試驗數據采用DPS軟件進行處理，LSD多重比較法進行單因素方差分析，用EXCEL軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 菌包內理化指標變化

2.1.1 含水量 菌包內水分來源于兩方面，一是原料栽培料配置所添加的水，表現為原始菌包的含水量，二是菌絲通過新陳代謝產生的水分，表現為菌包內含水量增高。因此含水量的變化在一定程度上反映了培養基質的分解程度。從圖1可以看出，銀耳菌包在不同培養溫度下含水量變化具有明顯差異。在培養過程中銀耳菌包的含水量在3個溫度下變化趨勢一致，均不斷上升，其中在24℃下菌包內含水量變化最大，菌包中含水量明顯高于20、28℃，培養20 d菌包含水量達到67.5%；20、28℃下菌包培養過程含水量變化基本一致，差別微弱。說明24℃下菌絲菌絲生長發育比較旺盛。

圖1 不同培養溫度下銀耳菌包的含水量變化

2.1.2 pH值 食用菌在代謝過程，通過對碳水化合物的吸收、利用，會產生酸性或者堿性代謝產物影響基質中的pH，因此基質中酸堿度的變化速度，在一定程度上可以反應出菌絲的營養代謝情況。從圖2可以看出，剛滅菌的菌包原始pH值一致，均在5.3左右，隨著培養時間的推進，銀耳菌包中栽培料的pH逐漸上升，培養0～20 d菌包pH上升幅度最大，進入出耳階段（培養20～30 d）栽培料的pH維持在一定水平（6.7左右）。其中24℃培養條件下，銀耳菌包內的培養料的pH變化速度明顯高于20、28℃條件下。pH變化大說明菌絲活力大，代謝能力強，轉化快，24℃下香灰菌絲代謝強度最大。

圖2 不同培養溫度下銀耳菌包的pH變化

2.1.3 可溶性蛋白含量 食用菌的新陳代謝是通過對外界碳水化合物的分解利用而進行的，外界碳水化合物如纖維素、半纖維素、木質素的分解利用主要通過真菌分泌到胞外基質降解酶的分解作用，因此基質降解酶是胞外可溶性蛋白的重要組成部分，胞外可溶性蛋白的變化間接反應了真菌對基質的分解利用能力。

由不同培養溫度下銀耳菌包可溶性蛋白含量的變化（圖3）可知，剛滅菌的初始菌包內可溶性蛋白含量很低，隨著培養時間延長，菌包內可溶性蛋白含量迅速增加，在培養20 d達到最大值；進入出耳階段后，隨著菌包的繼續培養，菌包內可溶性蛋白含量開始迅速下降。其中24℃條件下培養20 d可溶性蛋白含量高達258 μg/g，比20、28℃條件下的蛋白含量高，20℃和28℃溫度下菌包內可溶性蛋白含量接近，說明24℃條件下由于菌絲生長發育比20、28℃要旺盛，分泌的胞外酶最多，對基質的分解利用能力最強。

圖3 不同培養溫度條件下銀耳菌包內可溶性蛋白變化情況

2.1.4 還原糖含量 真菌對纖維素、木質素等碳水化合物不能直接利用，需要借助相應的降解酶降解成還原糖再進行利用，因此還原糖的變化體現了真菌對碳水化合物的供應和轉化能力。

還原糖隨培養時間變化（圖4）顯示，3種溫度下菌包培養0～20 d（菌包培養階段）還原糖隨培養時間增加呈不斷增加趨勢，培養20～30 d（出耳階段）呈下降趨勢，降幅較緩慢。不同溫度培養條件下菌包內還原糖含量差異明顯，24℃＞28℃＞20℃，其中24℃下培養20 d達到高峰875 μg/mL，顯著高于20℃與28℃（僅800 μg/mL左右）。前期菌絲生長代謝旺盛，對碳水化合物轉化快，產生足量的還原糖為生殖生長提供充足的養料基礎，還原糖逐漸積累，以24℃培養條件下銀耳菌絲原料轉化效果最好。

圖4 不同培養溫度條件下銀耳菌包內還原糖變化情況

2.1.5 總糖含量 食用菌通過分解培養料中的纖維素、木質素等多糖轉化為自身生長代謝所需，不斷消耗培養料中的多糖，并最終產生為水和CO2，隨著培養料多糖不斷轉化為CO2釋放入空氣中，導致培養料的糖總量不斷減少，因此培養料中總糖變化情況可以直接說明食用菌對原料利用的強弱。

由總糖含量變化情況（圖5）可知，3種溫度下菌包內總糖含量均隨著培養時間延長逐漸降低。總糖含量平均以1%（總糖/料干重）左右的速率降低，培養30 d后，總糖下降30%左右。其中24℃條件下總糖下降幅度最大，20℃與28℃下降速率接近，這是由于24℃條件下菌絲代謝旺盛，碳源糖類物質比20℃和28℃的消耗大，因此菌包內剩余總糖量相對低一點。

圖5 不同培養溫度條件下銀耳菌包內總糖變化情況

2.2 菌包酶活變化

2.2.1 羧甲基纖維素酶活力變化 木屑、棉籽殼含有大量的纖維素與半纖維素，是銀耳栽培的主要原料，食用菌不能直接利用，通過纖維素酶的酶解作用，纖維素被分解成碳水化合物和氨基酸以構成細胞物質和供給食用菌生長發育所需的能量。培養過程中始終存在降解纖維素的過程，為后期出耳提供充足營養。

從圖6可以看出，3種培養溫度條件下銀耳菌包培養0～25 d纖維素酶活力均逐漸提高，進入出耳階段后（培養20 d）酶活力基本穩定在200 U/mL以上。其中培養0～25 d酶活力增幅較大，培養25～30 d酶活力上升幅度極小，基本平穩；纖維素酶活力以24℃下最大，20℃下酶活最小。

圖6 不同培養溫度銀耳菌包羧甲基纖維素酶活力變化情況

2.2.2 淀粉酶活力變化 淀粉酶可降解培養料中的大量淀粉等多糖類，水解為單糖后才能供給菌絲生長發育，因此淀粉酶也是菌絲生長過程碳代謝中的關鍵酶之一。從淀粉酶活性隨菌包培養時間的變化（圖7）可以看出，3種溫度下菌包在培養0～15 d酶活逐漸上升，15～30 d酶活力逐漸下降。其中，前期24℃酶活上升幅度最大，于15 d出現峰值2 210 U/mL，而20℃下峰值僅1 850 U/mL；后期28℃下酶活降幅最大，24℃下降最少。整個過程均以24℃下酶活力最大，這可能是由于24℃下菌絲的生長發育最強，菌絲活力最大。

2.2.3 中性蛋白酶活力變化 蛋白酶在菌絲吸收氮素營養過程中起著至關重要的作用。菌絲生長發育所需要的氮源來自蛋白酶的水解作用，通過蛋白酶將栽培料中的蛋白質分解成氨基酸、尿素、氨等小分子化合物。

中性蛋白酶活性隨培養時間的變化見圖8。在菌絲培養階段，3個溫度條件下，培養0～15 d蛋白酶活力呈增長趨勢，培養15 d達到最大值，之后隨著培養時間的繼續延長蛋白酶活力開始下降。其中24℃培養條件下蛋白酶活力最高，20℃與28℃下差別不大；24℃下菌絲活力最強，氮源需求量最多，降解蛋白質最多，促進酶活分泌最多。

圖7 不同培養溫度銀耳菌包淀粉酶活力變化情況

圖8 不同培養溫度銀耳菌包中性蛋白酶的變化情況

2.2.4 漆酶活力變化 漆酶是一種與木質素分解相關的多酚氧化酶，在食用菌生長過程中通過分解木質素為菌絲提供營養物質。另外，有研究表明，漆酶的代謝產物醌能增強菌種的抗病能力，抑制雜菌的污染。

從漆酶活性隨培養時間的變化（圖9）可以看出，培養0～15 d漆酶活力隨培養時間延長而不斷上升到峰值，培養15 d后酶活一直下降直至檢測不到。其中24℃的酶活最高，培養15 d達到74 U/mL，菌絲培養過程中，菌絲代謝由弱變強，菌絲的抗病能力增強可能是由于袋料基質中漆酶代謝產物不斷積累而抑制了漆酶的活性。

圖9 不同培養溫度銀耳菌包漆酶的變化情況

2.3 菌包培養中菌絲生長情況

菌包在接種后分別置于20、24、28℃下進行菌絲培養，菌絲培養過程中定時取樣拍照，觀察菌絲生長情況和菌包的顏色變化，見表1和圖10。從圖10（彩插一）和表1可以看出，隨著培養時間的延長，菌圈直徑不斷擴大，28℃條件下菌袋表面菌圈直徑比24℃和20℃大，但中下部菌絲吃料比24℃要弱；黑色素分泌隨培養時間的延長不斷增加，培養18 d表面觀察黑色素均較多。

圖10 不同溫度培養銀耳菌絲及菌包顏色變化

表1 不同培養溫度的菌包菌絲變化情況

2.4 銀耳采收農藝性狀

從圖11（彩插一）、表2可以看出，20℃條件下銀耳朵型較圓正，耳片呈淡黃色，耳片較大頂部分叉，隆起度較低，收縮不夠緊密，不厚實；24℃條件下銀耳朵型圓正，耳片白色肉肥厚，整朵成圓形，有光澤，厚實；28℃條件下銀耳朵型不夠圓正不規則，耳片較大頂部分叉且呈黃色，隆起度低，耳片收縮較差，不厚實。不同溫度條件下出耳直徑和隆起度測定結果表明，24℃條件下出耳直徑與隆起度略高于20℃，28℃條件下出耳直徑、隆起度最低。

圖11 不同溫度條件銀耳出耳情況

表2 不同溫度下出耳的銀耳農藝性狀

2.5 菌包不同培養溫度條件下銀耳采收重量

從圖12可以看出，不同溫度條件下培養的菌包，出耳產量差異顯著。其中，24℃條件下銀耳單袋的平均產量可以達到90 g，20℃的單袋產量為75 g，28℃的產量只有55 g，比24℃低產40%左右。

圖12 不同溫度條件下出耳的單朵銀耳平均干重

3 討論

不同培養溫度影響銀耳菌包培養過程中理化參數（含水量、pH、還原糖、總糖、可溶性蛋白）的測定結果表明，24℃條件下銀耳菌包內含水量、pH、總糖變化速度最大，還原糖、可溶性蛋白積累量明顯高于20、28℃，這可能是由于在24℃培養條件下菌包菌絲生長最旺盛、活力最強。為了供應自身生長和代謝的需要，分泌更多的胞外酶消耗栽培料中的多糖，導致栽培料中總糖下降加快，轉化成更多的還原糖供應消化吸收，產生大量的酸性或者堿性代謝產物和水分，胞內含水量、pH變化更為明顯，這與斑玉蕈研究的結果部分相同［12］，但由于銀耳生長特性與斑玉蕈的不同，存在一定差異。

栽培料的酶活力變化能反映菌絲對培養料的利用情況。銀耳菌絲不能直接吸收纖維素、淀粉、蛋白等大分子物質作為能源，必須要靠香灰菌分泌相應的酶將大分子物質降解成小分子，才能供銀耳菌絲直接利用。24℃條件下菌包內菌絲代謝最強，相應的菌絲分泌胞外蛋白最多，體現出高基質降解酶活力。栽培料內含有大量纖維素，長期需要有纖維素酶進行纖維素降解，因此羧甲基纖維素酶菌絲發育期酶活逐漸上升，在吐蕾期及出耳期酶活一直保持較高的水平，這與在白靈菇、香菇、平菇上的研究相似［13-14］，后期纖維素酶一直保持較高的活性，滿足了子實體生長發育對碳源的需求，其原因可能是子實體生長發育促進纖維素的降解，這與對香菇的研究結果相似［15］。淀粉酶活力前期迅速上升，后期又較快速下降，變化趨勢與白靈菇和金針菇等食用菌的研究結果相似［14，16］。淀粉在菌絲生長期是最先被利用的，而淀粉酶是一種誘導酶，前期培養料中有大量淀粉，菌絲生長增殖旺盛需要大量淀粉被分解，因而酶活上升較快，隨著培養料中淀粉類物質被逐漸消耗，酶活下降。蛋白酶活力的變化趨勢在菌絲營養期不斷上升，原基發育期酶活快速下降，子實體生長期酶活上升并維持在較高的水平，這與姬松茸的研究結果相似［17］，子實體生長期分解培養料中蛋白質利用培養料中氮源，滿足實體中的生長。漆酶活力隨培養時間呈先上升后下降趨勢，與金針菇的培養過程的研究相似［18］，漆酶不僅參與木質素的降解，還可產生酚類或醌類化合物抑制雜菌生長。

菌包培養的溫度條件不同，最終的產量存在差異，從產量統計結果看，24℃培養的菌包，其產量明顯高于28℃的產量，這可能是由于菌絲長期處于28℃的溫度下，菌絲活力弱，菌絲易吐黃水，造成爛耳蒂，最后產量較低，而20℃培養的菌絲，活力較弱，對基質的養分吸收轉化較低，導致產量低。從整個培養過程中測定的生理生化參數來看，24℃條件下菌包總糖消耗率和胞外基質降解酶活力最高，因此24℃培養條件下出耳產量顯著高于20、28℃。

本研究明確了不同溫度下銀耳菌絲培養階段菌包內的生理變化規律以及不同溫度對銀耳出耳的影響，為銀耳栽培溫度的控制提供了理論依據，可望應用于銀耳的工廠化生產管理。

［1］戴玉成，楊祝良. 中國藥用真菌名錄及部分名稱的修訂［J］. 菌物學報，2008，27（6）：801-824.

［2］戴玉成，周麗偉，楊祝良，等. 中國食用菌名錄［J］. 菌物學報，2010，29（1）：1-21.

［3］黎勇，王曉東，高敏. 我國銀耳的研究歷史及現狀［J］. 北方園藝，2014（16）：188-191.

［4］羅信昌. 中國銀耳研究之歷史回顧［J］. 菌物學報，2013，32（Z1）：14-19.

［5］國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員. GB/T 9695.31-2008肉制品總糖含量測定［S］. 2008.

［6］薛丹，黃豆豆，姚風艷，等. 中藥木瓜中總糖及還原糖的含量測定［J］. 中國醫藥導報，2016，121（12）：121-124，128.

［7］牛建峰，王廣策，曾呈奎，等. 帶形蜈蚣藻多糖和可溶性蛋白含量測定及藻紅蛋白分析鑒定［J］. 海洋科學，2006，30（8）：50-53.

［8］趙玉萍，楊娟. 四種纖維素酶酶活測定方法的比較［J］. 食品研究與開發，2006，27（3）：116-118.

［9］孫靜，耿慧莉，莫德馨. 中溫α-淀粉酶活性的定量測定［J］. 教學儀器與實驗，2009，25（11）：44-45.

［10］中華人民共和國專業標準. SB/T 10317-1999 蛋白酶活力測定法［S］. 1999.

［11］郭艷艷，阮玲云，馮宏昌，等. 不同營養條件下斑玉蕈菌絲生長及產酶特性［J］. 菌物學報，2014，33（3）：697-705.

［12］黃清榮，辛曉林，王艷華，等. 真姬菇深層培養條件的研究［J］. 安徽農業科學，2006，34（3）：461-463.

［13］周長青，王秀峰，李玉. 白靈菇生長發育過程中胞外酶活性的變化規律［J］. 食用菌學報，2008，15（2）：64-68.

［14］潘迎捷，陳明杰，鄭海歌，等.香菇和平菇生長發育中漆酶、酪氨酸酶和纖維素酶活性的變化［J］. 上海農業學報，1991（2）：21-26.

［15］王玉萬. 銀耳及其伴生菌營養生理生態研究［J］. 應用生態學報，1993，4（1）：59-64.

［16］李蕤，吳克，駱軍，等. 金針菇固體培養幾種胞外酶活力變化的研究［J］. 中國食用菌，2002，21（1）：12-14.

［17］林新堅，江秀紅，林戎斌，等. 姬松茸菌株的胞外酶活性及與產量的關系［J］. 食用菌學報，2007，14（3）：24-28.

［18］高金權，劉朝貴，李成瓊，等. 稻草秸稈栽培金針菇基質降解特性研究［J］. 中國農學通報，2005，21（12）：260-264.