TLR4在原發性高尿酸血癥患者外周血單個核細胞中的表達①

孫佳斌，李曉光，逄德志，張金波，謝偉裕，鄭佳音，王茉琳

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

TLR4在原發性高尿酸血癥患者外周血單個核細胞中的表達①

孫佳斌，李曉光，逄德志，張金波，謝偉裕，鄭佳音，王茉琳

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：探討TLR4信號通路在原發性高尿酸血癥患者外周血單個核細胞中的表達情況。方法：利用Western-blot檢測實驗組與對照組患者外周血單個核細胞中TLR4、NF-κB的蛋白表達情況，應用ELISA法檢測各組受試對象血漿IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10的表達情況。結果：實驗組TLR4、NF-κB的蛋白表達水平，血漿IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)。結論：原發性高尿酸血癥患者外周血單個核細胞中TLR4信號及相關致炎和抗炎因子表達異常，TLR4可能通過調節免疫反應參與原發性高尿酸血癥患者病程的發生與發展。

TLR4；高尿酸血癥；炎癥

高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)是指在正常嘌呤飲食狀態下，非同日兩次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L，女性高于360μmol/L，即稱為高尿酸血癥[1]。研究表明HUA與心腦血管系統疾病、內分泌疾病和慢性腎臟疾病等密切相關，是這些疾病發生和發展的獨立危險因素[2]。有報道顯示在無癥狀高尿酸血癥患者中存在微炎癥狀態[3]，Toll受體活化后會募集MyD88 (myeloiddifferentiationfactor-88)，進而激活核轉錄因子-KB(Nuclearfactor-kappaB,NF-kB)，活化的NF-KB啟動促炎細胞因子、趨化因子、黏附分子等相關靶基因的轉錄，這些細胞因子在炎癥反應中發揮著關鍵作用，經過一系列復雜的生化反應產生級聯放大效應[4]。本研究通過檢測外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)Toll樣受體的表達水平，核蛋白NF-κBp65、白細胞介素-1β(IL-1β)的含量，血漿尿酸濃度，分析Toll樣受體與痛風炎癥反應之間的聯系及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2015-06～2016-05在佳木斯大學附屬第一醫院就診及體檢人群50例，其中健康對照(HC)20例，男18例，女2例，年齡(45.25±5.37)歲，原發性高尿酸血癥(HUA)30例，男27例，女3例，年齡(47.58±5.82)歲，入選者需符合原發性高尿酸血癥診斷標準，并排除心血管系統疾病、糖尿病、痛風、腫瘤、急性感染性疾病及自身免疫病。各組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 試劑與儀器

TLR4、NF-κB抗體購自美國Santacruze公司，人IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10酶聯免疫吸附試劑盒購自博士德生物工程有限公司，淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司；電泳儀(天能公司)，酶標儀(Gene公司)，低溫高速離心機(Beckman公司)。

1.3 樣本采集

抽取實驗組與對照組受試者靜脈血5mL，2000r/min離心10min取血漿，剩余的血細胞用PBS稀釋后加入淋巴細胞分離液上層，2000r/min離心10min，吸取懸浮在中層的單個核細胞，PBS洗3次，-80℃保存備用。

1.4 蛋白提取及Western-blotting檢測

常規方法提取腦組織蛋白，BCA法蛋白質濃度測定。上樣，濃縮膠80V，分離膠120V恒壓電泳，恒流200mA電流，轉膜1h。牛奶封閉1h，一抗4℃過夜，二抗孵育，ECL顯影。

1.5 酶聯免疫吸附實驗測定血漿細胞因子

按說明書操作，配制標準品，稀釋血清樣本，上樣、孵育、洗板等，讀取吸光值，繪制蛋白標準曲線，計算血清樣本濃度。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 兩組受試者血尿酸水平的比較

HC組受試者尿酸值為312.28±81.35，HUA組受試者尿酸值為533.11±72.91，HUA組血尿酸水平顯著高于HC組(P<0.05)。

2.2NLRP3炎性體蛋白表達情況

隨著尿酸水平的升高，實驗組TLR4、NF-κB的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，見圖1、表1。

2.3 血漿IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10的表達

實驗組IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，見表2。

圖1 Western檢測各組TLR4、NF-κB蛋白表達情況

表1 各組TLR4、NF-κB蛋白的表達情況

表2 血漿IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10的表達

3 討論

TLR4做為固有免疫的模式識別受體，能夠識別多種微生物及代謝物的激活信號如胰島淀粉樣多肽、膽固醇晶體、尿酸鹽晶體等[5]，有報道顯示可溶性尿酸鹽較MUS更易刺激TLR4和IL-1β的表達。因此我們假設TLR4作為炎癥反應的始動器，可能參與高尿酸血癥患者體內炎癥反應的發生、發展。本研究顯示原發性高尿酸血癥患者外周血單個核細胞中TLR4、NF-κB的表達水平高于對照組，表明TLR4介導的炎癥反啟動了高尿酸血癥患體內的炎癥狀態，同時參與了病程的進展。TLR4被激活后可以進一步激活炎癥反應的誘發因子IL-1β和IL-8，進一步放大機體的炎癥反應，IL-1β是促進多種代謝性疾病發生、發展的重要炎癥因子,IL-8作為一種趨化因子，能激活中性粒細胞、嗜堿性粒細胞，使大量中性粒細胞向炎癥部位聚集，因此，IL-8既是免疫反應的啟動因子，又是持續炎癥反應的誘發因子。本研究顯示原發性高尿酸血癥患者血漿中IL-1β和IL-8表達水平顯著高于對照組，證實IL-1β和IL-8被TLR4激活后能進一步擴大炎癥反應，參與病程進展。此外，本研究發現HUA組血漿IL-4、IL-10等抗炎性因子均顯著升高，提示機體通過免疫調節釋放抗炎性細胞因子，以便抑制和減輕由炎性細胞因子導致的炎癥狀態?？傊接懺l性高血尿癥患者TLR4信號及其相關的細胞因子表達變化，對于高尿酸血癥病程的進展，炎癥反應之中的作用，預防合并癥的發生、發展有著重要的臨床意義。

[1]李復興. 飲水與高尿酸血癥[J].中國食品,2016，(3):36

[2]鄒大進.無癥狀高尿酸血癥治療的必要性[J].中華醫學會第十三次全國內分泌學學術會議會議指南，2014,(8):136-138

[3]趙勁濤，黃勝華，連希艷，等. 無癥狀高尿酸血癥對微炎癥狀態的影響[J].臨床內科雜志, 2012, 29(7):460-462

[4]PaulPT,GarySF.NF-κB:akeyroleininflammatorydiseases[J].JClinInvest,2001，107(1):7-11

[5]ShawPJ,McDermottMF,KanneganitiTD.Inflammasomesandautoimmunity[J].TrendsinMolecularMedicine,2011,17(2):57-64

The study on the expression of TLR4 in patients with primary hyperuricemia

SUNJia-bin,LIXiao-guang,PANGDe-zhi,

ZHANGJin-bo,XIEWei-yu,ZHENGJia-yin,WANGMo-lin

(Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

Objective: To study the expression of TLR4 signal pathway in patients with primary hyperuricemia. Methods: TLR4, NF-κB were measured by using Western-blot between experimental group and control group. The expressions of IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10 were measured by using ELISA in plasma with all groups. Results: The expression of TLR4、NF-κB gene protein increased significantly, and the expression of IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10 increased significantly in patients with experimental groups compared with control group. Conclusion: Dysregulated expression of TLR4, associated inflammatory and anti inflammatory cytokinesis with it may be involved in the development of disease by regulating inflammotatory response; and play a key role in the primary hyperuricemia.

TLR4;primary hyperuricemia;inflammation

1. 黑龍江省大學生創新創業訓練計劃項目，編號：201610222051；2.黑龍江省衛生計生委科研課題，編號：2014-264；3.佳木斯大學青年項目，編號：Sq2013-019；4.佳木斯大學面上項目，編號：JMSUJCM2016-043。

孫佳斌(1994～)男，黑龍江佳木斯人，在讀本科學生。

王茉琳(1981～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，講師。E-mail:81molin@163.com。

R

A

1008-0104(2017)01-0015-02

2016-10-20)