左乙拉西坦對難治性癲癇大鼠海馬組織中Slit2表達的影響①

聶 磊，畢艷旭，苗小風，王 影，王海燕

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

左乙拉西坦對難治性癲癇大鼠海馬組織中Slit2表達的影響①

聶 磊，畢艷旭，苗小風，王 影，王海燕

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察左乙拉西坦對難治性癲癇大鼠海馬組織中Slit2表達的影響。方法：Wistar大鼠隨機分為對照組，模型組(IE組)，治療組(LEV治療組)，LEV對照組(LEV組)。腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品建立難治性癲癇大鼠模型，造模成功后LEV組和LEV治療組給予LEV200mg/(kg·d)灌胃，對照組和IE組給予等量生理鹽水，應用免疫組化法在第1周、2周和4周檢測各組海馬組織中Slit2的表達量。結果：LEV組和對照組比較，Slit2的表達量差異無統計學意義(P>0.05)；IE組Slit2表達量明顯降低，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；LEV治療組與IE組比較，Slit2表達量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。結論：Slit2的表達變化促進海馬發生苔蘚纖維化(MFS)參與難治性癲癇形成，LEV控制癲癇發生，可能與上調Slit2的表達有關。

難治性癲癇；左乙拉西坦；Slit2；大鼠

癲癇是由大腦神經元反復發作的異常放電引起的、以中樞神經系統功能失常為特征的慢性腦部疾病，約20%～30%患兒發作不能得到有效控制，稱為難治性癲癇(refractoryepilepsy,RE)。兒童RE診斷標準為：對于已正確診斷的癲癇患兒，應用正規抗癲癇藥物(2種以上)合理治療6個月到1年后，發作仍未能減少50%者為兒童RE[1]。在RE的發病機制中，神經網絡結構重組是其病理特征，海馬苔蘚纖維發芽(mossyfibersprouting，MFS)被認為是其發生、發展以及耐藥的關鍵之一，其促使大腦形成異常興奮性網絡結構。神經軸突導向因子Slits家族之一Slit2目前研究最為廣泛，主要在神經元中表達，而在癲癇患者中，其在星形膠質細胞和神經元中均表達，研究證實其與MFS的發生密切相關[2]。RE的治療仍然以口服藥物為主，左乙拉西坦(levetiracetam,LEV)作為抗癲癇新藥，已經獲得了臨床的認可，取得了較好的臨床療效，尤其在RE的治療中起了巨大的作用[3,4]，但其具體的抗癲癇機制是尚不清楚。本實驗通過建立氯化鋰-匹羅卡品(lithium-pilocarpine，Li-pilo)點燃的RE大鼠模型，觀察LEV在不同時間點對Slit2表達的影響，探討LEV可能的抗癲癇機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性Wistar大鼠(哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK2013001)110只，清潔級，體重約180～220g，稱體重編號后隨機分成對照組24只、模型組(IE組)31只、治療組(LEV治療組)31只和LEV對照組(LEV組)24只。

1.2 動物造模

IE組和LEV治療組先給與氯化鋰(天津基準化學試劑有限公司)135mg/kg腹腔注射，24h后給與阿托品1mg/kg腹腔注射，20min后再腹腔注射匹羅卡品(美國Sigma公司)50mg/kg,然后觀察大鼠的行為。按照Racine癲癇行為分級[5]：0級:無反應或抽搐停止；I級:嘴和面部出現節律性抽動；Ⅱ級:嘴和面部出現節律性抽動,同時出現點頭；Ⅲ級:在Ⅱ級基礎上出現前肢抽動；Ⅳ級:出現后肢站立；Ⅴ級:全面性強直陣攣發作伴不自主跌倒。達到Ⅳ級及以上即視為造模成功，若發作程度達不到等級，于30min后再次給予未達等級大鼠注射匹羅卡品20mg/kg,直至達到發作等級。

1.3 灌胃給藥

將LEV片劑(UCBPharmaS.A.比利時)碾碎并溶解于生理鹽水中，給與LEV治療組和LEV組LEV(200mg/kg·d)灌胃，同時給予對照組和IE組等量的生理鹽水。

1.4 標本處理

于造模成功后各時間點，每組隨機抽取8只大鼠，10%水合氯醛麻醉，先后用生理鹽水100～200mL和4%的多聚甲醛200mL經左心室灌注，待大鼠肝臟變白及四肢抽動后斷頭取腦，將腦組織放入4%的多聚甲醛溶液中固定。

1.5 免疫組織化學方法

把經過固定和包埋的固態大鼠腦組織置于石蠟切片機上，切成約厚度為4μm的切片進行免疫組化染色，在顯微鏡鏡下(×100)觀察每張切片海馬區域陽性細胞數，隨機選取5個視野計算Slit2的陽性

細胞數，算得平均值后記錄。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 動物模型制作結果

腹腔注射Li-pilo約20～40min后，大鼠開始出現癲癇發作，持續抽搐30min以上腹腔注射10%水合氯醛5mL/kg止痙，降低死亡率，實驗中5只大鼠死亡，2只未出現抽搐，3只未達發作等級，均予以剔除。

2.2 海馬組織Slit2表達量

Slit2陽性細胞數：LEV組和對照組比較，Slit2的表達量差異無統計學意義(P>0.05)；IE組Slit2表達量明顯降低，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；LEV治療組與IE組比較，Slit2表達量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠海馬區Slit2陽性細胞數(個/高倍視野

注：a與對照組相比:P>0.05；b與對照組相比：P<0.05；c與對照組相比：P<0.05；d與IE組相比，P<0.05。

3 討論

癲癇是兒童時期常見的神經系統疾病之一，兒童是一個不斷發育和成熟的過程，RE對其身心健康造成嚴重影響，若發展為難治性癲癇持續狀態(refractorystatusepilepticus,RSE)，其死亡率達16%～39%[6]，無論對患兒本人、家庭還是社會都會造成嚴重的后果。Slits家族在神經軸突導向、神經細胞遷移、神經細胞形態分化等多種生命活動有重要的調節作用，其功能主要通過LRR-2(leucine-richrepeat2)結構域與Robos結構域結合實現。在雙側對稱的生物，中線是發育中神經系統的重要中介部位，是動物傳遞左右兩側信息以及協調運動和整合感覺輸入的基礎，大多數的軸突投射到對側前要越過中線，然而這些軸突并不是毫無秩序、混亂或者反復穿越中線，中線穿越的過程離不開Slits的精細調控[7]。Slit基因敲除后，許多軸突連接不能離開中線，甚至有些軸突連接反復跨越中線[2]。在對小鼠視網膜軸突發育的研究實驗、雞和小鼠胚胎腦干縱向軸突發育實驗以及人類胚胎干細胞多巴胺能神經軸突培養的體外實驗均證實Slits對神經元軸突有排斥作用，Slits作為排斥性因子，保證了神經元軸突只跨越中線一次，準確無誤到達既定位置，阻止軸突反復跨越中線形成異常的網格結構。Fang[2]等實驗發現，在RE動物模型中1天～2周，Slit2的表達持續減低，認為這不是癲癇發生的原因，而是對神經元癇性放電的一種適應性變化，同時也提示下調Slit2后可能會促進MFS，干擾神經的正常連接，在RE的發病機制中有所參與。

LEV作為新型抗癲癇藥，具有大腦保護作用[8]，同時又其他抗癲癇藥物不具有的優點，比如；生物利用度高、線性藥動力學曲線、血漿蛋白結合率低、無肝酶誘導作用等，總之具有較高的安全性。大量的國內外臨床研究證實，左乙拉西坦在難治性癲癇的治療中效果顯著[9，10]，而關于其具體的抗癲癇機制尚不十分清楚。本實驗的研究中，我們發現LEV治療組與模型組相比，Slit2的表達升高，結合Slit2與MFS密切相關的功能，因此，推測LEV可能通過增加Slit2的表達，阻止甚至逆轉大腦海馬組織發生苔蘚纖維化，一定程度上減輕異常神經網絡結構的形成，降低癲癇發作的敏感性，控制難治性癲癇的發作。

[1]顧碩，王治平，鮑南,等.多學科協作模式診斷和治療兒童藥物難治性癲癇研究[J].中國實用兒科雜志，2014，29(12)：909-912

[2]FangM,LiuGW,PanYM,etal.AbnormalexpressionandspatiotemporalchangeofSlit2inneuronsandastrocytesintemporallobeepilepticfoci:Astudyofepilepticpatientsandexperimentalanimals[J].BrainRes，2010, 1324:14-23

[3]LeeYJ，KangHC，KimHD，etal.Efficacyandsafetyofadjunctivelevetiracetamtherapyinpediatricintractableepilepsy[J].PediatrNeurol，2010，42(2):86-92

[4]SheinbergR,HeymanE,DaganZ.CorrelationBetweenEfficacyofLevetiracetamandSerumLevelsAmongChildrenWithRefractoryEpilepsy[J].PediatrNeurol,2015,52(6)：624-628

[5]RacineRJ.Modificationofseizureactivitybyelectricalstimulation.Motorseizure[J].EletroencephalogrClinⅡNeurophysiol,1972,32(3):281-294

[6]SinghalA,TripathiM.Refractorystatusepilepticus[J].NeurologyAsia, 2013, 18: 67-71

[7]于奇，周啟升，趙曉,等.神經軸突導向分子Slit的功能及其分子作用機制研究進展[J].生理學報，2012，64(2):220-230

[8]裴艷瑩，鄒艷紅，王海燕,等.左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中CAMKⅡ及NCX3 表達的影響[J].黑龍江醫藥科學，2015，38(4)：26-28

[9]GrossoS,FranzoniE,CoppolaG,etal.Efficacyandsafetyoflevetiracetam:anadd-ontrialinchildrenwithrefractoryepilepsy[J].Seizure,2005,14(14):248-253

[10]舒志剛,衛國. 左乙拉西坦治療低齡難治性癲癇患兒臨床研究[J]. 中國實用神經疾病雜志,2014,17(2)：4-6

The effect of levetiracetam on the expression of Slit2 in hippocampus of rats with refractory epilepsy

NIELei,BIYan-xu,MIAOXiao-feng,WANGYing,WANGHai-yan

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China)

Objective: To observe the effect of levetiracetam (LEV) on Slit2 in hippocampus of rats with fractory epilepsy. Methods: Wistar rats were randomly divided into control group, model group (IE group), treatment group (LEV treatment group), and LEV control group (LEV group). Refractory epilepsy rat modes were induced by intraperitoneal injection of lithium-pilocarpine; LEV group and LEV treatment group were given levetiracetam(200mg/kg per a day) by filling the stomach after the mode was established successfully; the control group and IE group were given the same dose of saline solution. The expression of Slit2 in rat hippocampal's tissues were detected respectively at the 1st week, 2nd week and 4th week by immunohistochemical method. Results: There was no significant difference between LEV group and control group(P>0.05).Comparedwiththecontrolgroup,theexpressionofSlit2ofIEgroupdecreasedsignificantly(P<0.05).ComparedwithIEgroup,theexpressionofSlit2ofLEVtreatmentgroupincreasedsignificantly(P<0.05). Conclusion: The expression of Slit2 promotes rat hippocampal mossy fiber sprouting(MFS) involving in the formation of refractory epilepsy. Levetiracetam is correlated with raising expression of Slit2 and reducing MFS when it controls the incidence of seizures during curing the refractory epilepsy.

refractory epilepsy; levetiracetam; Slit2; rat

佳木斯大學科學技術研究項目，編號：13Z1201542。

聶磊(1977～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫師。

王海燕(1957～)女,黑龍江佳木斯人,碩士，主任醫師,教授，碩士研究生導師。E-mail：yhw1957@126.com。

R

B

1008-0104(2017)01-0050-03

2015-11-10)