MTT法與CCK—8法檢測兔視網膜色素上皮細胞活性的比較研究

楊冬萍 楊曉旭 俞洋

【摘要】目的：探討MTT法和CCK-8法對細胞活性檢測的最佳實驗條件，并比較二者的優缺點。方法：取傳至第5代的兔視網膜色素上皮細胞為研究對象，分別用MTT試劑和CCK-8試劑檢測兔視網膜色素上皮細胞的增殖情況。結果：MTT法最佳檢測波長為570nm，最佳檢測時間在加入試劑后4h，細胞數量在125×103～2×104之間檢測較好；CCK-8法最佳檢測波長在450nm，最佳檢測時間在加入試劑4～6h，適宜的細胞檢測范圍為125×103～1×104。結論：MTT法較CCK-8法細胞檢測范圍更廣，孵育時間更短，是一種優于CCK-8法的細胞活性檢測方法。

【關鍵詞】MTT；CCK-8；兔視網膜色素上皮細胞；細胞活性

【中圖分類號】R-332【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）06-0031-04

檢測細胞活性與增殖的方法有很多，如乳酸脫氫酶釋放法、臺盼藍拒染法、集落形成法、流式細胞儀法、熒光染色法、MTT比色法等，其中，MTT比色法自1983年Mosmann建立以來，由于其簡便、快速、經濟等優點，現已廣泛用于細胞實驗，成為定量檢測細胞生長和增殖的理想方法[1]。但由于MTT生成的產物Formazan為非水溶性的，需要有機溶劑（DMSO、異丁醇等）才能溶解，且在吸出培養液時可能會因操作不當，丟失部分Formazan，導致結果可重復性差。針對MTT法的不足，研究發現了很多水溶性的四氮唑藍類：如XTT法[2]、MTS法[3]、Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）法[4]等。本文以兔視網膜色素上皮細胞為研究對象，探討MTT法和CCK-8法對細胞活性檢測的最佳實驗條件，并對二者的優缺點做一比較。

1儀器與材料

11儀器E680酶聯免疫檢測儀（BIO-RAD公司）。

12[JP3]材料MTT試劑（南京凱基批號：2016114）；CCK-8試劑（日本同仁化學，貨號：CK04）；DMSO（Aladdin，CAs Number：67-68-5）；第5代兔視網膜色素上皮細胞。[JP]

2方法

21最佳檢測波長和最佳孵育時間的確定取對數生長期的兔視網膜色素上皮細胞，025%胰蛋白酶消化約3min，計數，以每孔細胞密度5×103個，接種于96孔板內，每孔100μL的細胞懸液，每組設4個復孔，96孔板四周用PBS填充，以避免孔內液體蒸發，放入37℃培養箱培養24h使細胞貼壁。CCK-8組每孔加入10μL CCK-8試劑，放入培養箱孵育1、2、3、4、6h后，用酶聯免疫檢測儀檢測各孔不同波長下的OD值；MTT組每孔加入50μL的MTT試劑，放入培養箱孵育1、2、3、4、6h后，吸出上清液，每孔加150μL的DMSO，避光搖床放置10min，用酶標儀檢測各孔不同波長下的OD值。酶標儀的內置檢測波長均為405、450、490、570、590nm。

22細胞數量與吸光度的關系將對數生長期的兔視網膜色素上皮細胞，以025%胰蛋白酶消化約3min，低速離心，計數，調整細胞密度，使每組細胞密度從高到低依次稀釋成2×104、1×104、5×103、25×103、125×103、63×102、31×102個/孔，接種于96孔板內，每個濃度組設6個復孔，放入37℃培養箱培養24h，待細胞貼壁后，分別加入10μL CCK-8試劑和50μL MTT試劑，在酶標儀上測量其OD值。

3結果

31最佳檢測波長的確定如圖1、2所示，在檢測兔視網膜色素上皮細胞活性時，MTT法和CCK-8法在不同的檢測波長條件下，OD值均變化明顯。其中MTT法在570nm波長處時，吸光峰值最高且最敏感；CCK-8法在波長450nm處時，吸光峰值最精準。因此，實驗中MTT法的最佳檢測波長應選570nm處，CCK-8法的最佳檢測波長選擇450nm處。

32最佳檢測時間的確定如圖1、2所示，MTT法在1～4h孵育時間內，表現為隨著反應時間的延長，OD值越來越高，呈上升趨勢，在4h時間點OD值達到最大，4～6h時段有下降趨勢；CCK-8法顯示：在1～6h不同孵育時間段內，其OD值與培養時間表現為正相關關系。因此，在檢測兔視網膜色素上皮細胞活性時，MTT法的最佳檢測時間應選擇在加入試劑孵育后的4h，CCK-8法的最佳檢測時間在加入試劑孵育后4～6h時間段都是可以的。

33細胞數量與吸光度OD值的關系由圖3可知，當兔視網膜色素上皮細胞數在31×102～2×104時，MTT法和CCK-8法均表現為隨著細胞數量的增多，OD值呈上升趨勢。其中MTT法細胞數在125×103～2×104之間時表現為良好的線性關系，CCK-8法適宜的細胞檢測范圍是125×103～1×104。

4討論

[JP2]MTT法原理是利用活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，將MTT[3-（4，5Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，簡稱噻唑藍]還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），而死細胞此酶消失，MTT不被還原。由于Formazan的生成量與活細胞數量及代謝活性有關，測定一定波長下光密度值（OD）的大小，可定量地反映活細胞數量及其活性的改變。研究表明，在一定的細胞濃度范圍內，光密度值的大小與活細胞的數量成正比[5]。CCK-8法的實驗原理與常規MTT法略有差異，CCK-8試劑中含有WST-8（水溶性四唑鹽），其在電子載體（1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸二甲酯）存在的情況下，可被活細胞線粒體內的一些脫氫酶還原成水溶性的橙黃色結晶，無需使用裂解液，也不需要吸棄培養液，可直接進行比色。[JP]

實驗探討了MTT法和CCK-8法檢測兔視網膜色素上皮細胞活性的最佳實驗條件，結果表明：MTT法最佳檢測波長為570nm處，最佳孵育時間為4h，結果與前人研究[6]相似，且不受細胞株的影響，合適的細胞檢測數量為125×103～2×104；CCK-8法最佳檢測波長為450nm處，最佳孵育時間為4～6h，適宜的細胞檢測范圍在125×103～1×104之間，當細胞數量少于125×103或高于1×104時，檢測結果均較差。說明MTT法和CCK-8法在檢測兔視網膜色素上皮細胞活性時，MTT法較CCK-8法細胞檢測范圍更廣，孵育時間更短，實驗結果更為穩定。

近年來，Cell Counting kit-8試劑由于其生成產物具有高度水溶性，無需裂解液裂解沉淀，同時也不需要吸出培養液，對貼壁和懸浮細胞均適用，且檢測后的細胞可重復利用[7]，具有操作簡便、快速、靈敏度高等優點，普遍受到人們的青睞。但缺點是CCK-8試劑價格較為昂貴，且試劑顏色為淡紅色，與含有酚紅的培養液顏色極其相似，加入試劑之后不會立即顯色，因此很容易造成漏加或者多加，并且CCK-8試劑加入量很少，如果不小心沾到壁上，很可能會導致結果的可重復性不是很好。相比較而言，MTT試劑價格低廉，試劑顏色為黃色，加入即刻顯色，不容易產生漏加現象，缺點是步驟繁瑣，由于其生成產物為水不溶性的，需要有機溶劑（如DMSO、異丁醇等）才能溶解，DMSO不僅具有一定的細胞毒性[8]，且對人體也有一定的危害。此外，MTT法在溶解Formazan之前，需要先吸棄培養液，因此此法不太適用于懸浮細胞，這也造成了一定的局限性，而且在溶解產物Formazan這一步驟中，還有可能會因Formazan溶解不了或溶解不充分，造成一定的結果偏差。針對傳統MTT法的不足之處，研究人員又進一步提出了改良的MTT法，可在不吸出培養液的情況下，通過添加一些有機溶劑如酸化SDS[9]、SDS-DMF酸性溶解液[10]等，可使Formazan直接溶解，并取得了不錯的效果。

自MTT法建立以來，不斷被改良，憑借其經濟、數據穩定、無放射性污染等優點已被廣泛用于細胞毒性試驗[11]、生物活性因子的活性檢測[12]、腫瘤細胞藥敏檢測[13]、抗腫瘤藥物大規模篩選[14]等。而且目前針對細胞毒性的檢測，《美國藥典》中已采用MTT法進行定量測定[15]。綜合比較發現，MTT法較CCK-8法應用前景更為廣闊，且相信隨著MTT法的不斷改進和完善，勢必會在實驗領域占據重要地位。

參考文獻

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[3]Rassendren Francois，Gary Buell，Alison Newbolt，et al.Identification of amino acid residues contributing to the pore of a P2X receptor[J].The EMBO Journal，1997，16（12）：3446-3454.

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[5]楊浩，王春婷，吳玉梅，等.細胞特性狀態及細胞數與OD值的關系探討[J].動物醫學進展，2002，23（5）：49-51.

[6]Sargent JM，Talyor CG.Appraisal of the MTT assay as a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid leukemia[J].Br J Cancer，1989，60（2）：206-210.

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[8]劉艷秋，張可華，王運良，等.CCK-8和MTS法檢測人羊膜上皮細胞增殖的比較[J].中國康復理論與實踐，2012，18（9）：827-830.

[9]薄華本，邵紅偉，胡凌波，等.細胞活性檢測方法優化[J].中國實用醫藥，2008，21（3）：1-2.