β-內酰胺類聯合氟喹諾酮類抗菌藥物治療銅綠假單胞菌感染機制研究進展

徐 輝，何曉靜，李曉冰，菅凌燕

·綜述·

β-內酰胺類聯合氟喹諾酮類抗菌藥物治療銅綠假單胞菌感染機制研究進展

徐 輝，何曉靜，李曉冰，菅凌燕*

銅綠假單胞菌是一種革蘭陰性菌，是醫院感染的主要致病菌之一，具有致病力強、病死率高等特點。由于近年來抗菌藥物的廣泛使用，致使銅綠假單胞菌臨床耐藥率大幅度增長，多重耐藥銅綠假單胞菌所造成的感染已成為臨床治療的熱點和難點。本文對β-內酰胺類聯合氟喹諾酮類抗菌藥物治療銅綠假單胞菌感染的機制進行綜述。

銅綠假單胞菌；多重耐藥；β-內酰胺類；氟喹諾酮類；聯合治療

0 引言

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是常見的條件致病菌，易引發呼吸系統及泌尿系統感染、敗血癥等疾病，對某些常見抗菌藥物具有敏感性。近年來，由于耐藥菌株的不斷產生，使PA感染的治療難度不斷增加。目前，雖然國內外對抗菌藥物聯合治療細菌感染觀點存在差異，但聯合用藥治療PA感染已經成為一種重要手段[1]。根據2014年銅綠假單胞菌下呼吸道感染診治專家共識，β-內酰胺類與氟喹諾酮類抗菌藥物聯合應用已經成為臨床治療PA下呼吸道感染的一種常見用藥方式[2]。本文針對近年來國內外β-內酰胺類與氟喹諾酮類抗菌藥物對PA耐藥機制的研究成果進行對比綜述，對兩種藥物聯合應用的可行性進行分析，為臨床用藥提供借鑒。

1 流行病學調查

據2009-2013年“中國CHINET細菌耐藥性監測”調查顯示[3-7]，在國內不同地區教學醫院所分離出的臨床分離菌株中，PA分離率居所有革蘭陰性菌分離率的第3～4位；根據連續監測數據顯示，PA對亞胺培南、頭孢他啶的年度耐藥率分別接近30%和20%，PA對環丙沙星、左氧氟沙星的年度耐藥率約為20%，泛耐藥PA菌株檢出率已達2.0%，抗PA治療的前景不容樂觀。有研究顯示，在國內某醫院收集的259例醫院獲得性肺炎(Hospital-acquired pneumonia，HAP)患者的痰液標本中，PA分離率高達22.0%，居所有分離菌株的首位，PA所造成的呼吸系統感染已經成為臨床上最常見的細菌感染之一[2,8]。

2 主要耐藥機制研究進展

2.1 產酶對β-內酰胺類抗菌作用的影響 β-內酰胺類抗菌藥物主要通過抑制PA的D-丙氨酰-D-丙氨酸轉肽酶，進而影響其細胞壁的正常合成而導致細菌死亡。β-內酰胺酶的產生是PA對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的最主要方式，主要包括頭孢菌素酶(Ampler class C β-lactamase，AmpC)、超廣譜β-內酰胺酶(Extend spectrum β-lactamases，ESBLs)和金屬β-內酰胺酶(Metallo-β-lactamases，MBLs)等。

Amp C酶主要以頭孢菌素為底物，并且克拉維酸等β-內酰胺酶抑制劑對其無抑制作用，可水解大部分抗PA β-內酰胺類藥物。大多數PA菌株天然存在Amp C基因，通常只表達少量Amp C酶。細胞壁代謝所產生的N-乙酰葡糖胺-N-乙酰胞壁酰三肽(G-aMT)，可通過兩種代謝途徑被調控蛋白Amp D分解為兩種代謝產物N-乙酞胞壁酰三肽(aMT)和乙酰胞壁酰五肽(UDP-aMP)。1997年，Jacobs[9]在對細胞壁與耐藥關系的研究中發現，當β-內酰胺類抗菌藥物存在時，部分細菌的細胞壁代謝底物aMT將在胞內大量積累并替代UDP-aMP，將轉錄調控因子Amp R激活，從而誘導Amp C酶高表達，形成產Amp C酶的耐藥菌株。

目前，在臨床分離的各類型革蘭陰性桿菌中，國內外學者已發現200余種ESBLs，在PA中已發現了8個群屬的ESBLs，其可通過質粒介導的方式導致多種細菌對β-內酰胺類抗菌藥物產生耐藥，多見于大腸埃希菌等腸桿菌屬[10]。PA中存在的ESBLs，主要以TEM、OXA、VEB、PER、CTX-M等群屬最為常見。因抗菌藥物使用特點的區別，各國家和地區ESBLs類型在不同細菌中具有較大的差異。對PA產生的ESBLs進行流行病學分析的結果顯示，巴西以CTX-M群屬最為常見，而在我國溫州地區的PA感染患者體液中收集到的460株PA中，54株PA攜帶TEM型ESBLs，占11.8%，CTX-M僅占總數的1.95 %[11-12]。

MBLs作為最廣譜的β-內酰胺酶，可水解除氨曲南外所有的β-內酰胺類抗菌藥物。MBLs主要包括IMP、SIM、VIM等類型，其中在亞洲地區多以IMP型和VIM型最為常見。大多數的MBLs位于耐藥細菌的Ⅰ類整合子中，常與其他耐藥基因共存，極易發生水平傳播。2007年，王杰等[13]從我國16個城市28家醫院收集的645株PA菌株中，檢測出22株MBLs陽性PA菌株，包括1株IMP-1型，13株IMP-9型，8株VIM-2型。MBLs高水平檢出率已成為導致PA對β-內酰胺類耐藥的重要因素之一。

2.2 靶位改變對氟喹諾酮類抗菌作用的影響 氟喹諾酮類抗菌藥物通過抑制細菌的DNA回旋酶和拓撲異構酶Ⅳ，從而抑制DNA合成，產生殺菌作用。DNA回旋酶是由兩個gyrA亞基和兩個gyrB亞基組成的四聚體，拓撲異構酶Ⅳ是兩個parC亞基和兩個parE亞基組成的四聚體，而其中的任意一個亞基突變都會導致細菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥。

近年來，質粒介導的氟喹諾酮類藥物耐藥機制(Plasmid-mediated quinolones resistance，PMQR)已逐漸成為氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥的重要機制之一；目前的研究已發現多種PMQR機制，分別為qnr、aac(6′)-Ib-cr、qepA及oqxAB基因編碼，攜帶耐藥基因質粒的菌株間傳播已經成為喹諾酮類耐藥的重要原因之一[14]。質粒所攜帶qnr、aac(6′)-Ib-cr等基因在一定程度上導致PA的MIC升高，使細菌對藥物的敏感性降低。Yang等[15-17]研究發現，在對氟喹諾酮類藥物高水平耐藥的菌株中，攜帶qnr基因的菌株較少，其原因可能是qnr基因可與DNA回旋酶和拓撲異構酶Ⅳ最易發生突變的喹諾酮抗性決定區域(Quinolone resistance determining region，QRDR)相結合，對QRDR產生保護作用，使攜帶qnr的菌株選擇壓力小于不攜帶qnr的菌株。

3 β-內酰胺類與氟喹諾酮類聯合治療銅綠假單胞菌感染可行性研究進展

2014年銅綠假單胞菌下呼吸道感染診治專家共識指出，多個臨床研究的Meta分析結果顯示：與單獨用藥治療PA感染相比，聯合用藥組患者病死率降低10%～20%；并且，將β-內酰胺類與氟喹諾酮類藥物聯用，可分別提高對PA的抗菌活性[2]。Zhao等[18]研究發現，在最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)之上還存在防突變濃度(Mutant prevention concentration，MPC)，血藥濃度低于MIC時，由于無選擇壓力，耐藥突變菌株不會富集產生，當血藥濃度高于MPC時，細菌需至少發生兩種耐藥突變才可正常生長，而自然狀況下細菌發生多次突變頻率非常低，耐藥菌株不會大量產生；MIC和MPC之間的濃度范圍稱為突變選擇窗(Mutant selection window，MSW)，當血藥濃度位于MSW時，耐藥突變菌株將選擇性富集擴增，導致細菌耐藥。抗菌藥物聯合使用時，由于兩類抗菌藥物的耐藥機制不同，單次突變菌群很難選擇性富集，致使MPC顯著降低、MSW縮小，能有效控制耐藥菌株的產生。對比美羅培南單藥治療PA感染和美羅培南分別與環丙沙星、左氧氟沙星聯合治療PA感染的藥敏結果顯示，美羅培南的突變選擇指數(Selection index，SI)由32分別降為2和4，抗菌藥物聯合使用后，美羅培南耐藥菌株出現頻率降低；Zhanel等[19-21]將β-內酰胺類與氟喹諾酮類抗菌藥物聯合使用，突變選擇指數同樣有不同程度的降低。

根據對PA基因組序列分析，介導PA產生耐藥的外排泵主要包括4種RND外排系統，分別為MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM，其結構包括內膜轉運蛋白、質膜融合蛋白和外膜通道蛋白[22]。四種RND外排泵亞型對喹諾酮類的轉運能力有顯著差異；不含氟的喹諾酮類抗菌藥(如哌啶酸、吡咯酸等)對MexEF-OprN最為敏感；左氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星等含氟原子的喹諾酮類藥物對MexCD-OprJ和MexEF-OprN較敏感，MexAB-OprM及 MexXY-OprM次之[23-25]。原因是氟喹諾酮類藥物中具有極性大、電負性強的氟原子，對攜帶正電荷的MexCD-OprJ等外排泵產生較強的電荷效應，導致親和力強。

在對β-內酰胺類藥物的研究中，大部分青霉素類、頭孢菌素類以及碳青霉烯類(除亞胺培南)藥物均可被內膜蛋白MexB識別；相比之下，MexD作用范圍較小，主要以羧芐青霉素、磺芐西林和頭孢他啶等藥物作為底物[24,26]。機制可能是具有賴氨酸殘基的MexD通過電荷作用對以負電荷存在的羧芐青霉素、磺芐西林等更有親和力。Sacha等[27]研究表明，MexAB-OprM過表達可明顯提高美羅培南的MIC，卻幾乎不影響PA對亞胺培南的敏感度。原因是美羅培南具有多個疏水末端與剛性側鏈，空間結構較大，導致美羅培南對內膜蛋白MexB遠端連接口袋敏感性強；而亞胺培南具有體積小、疏水性弱等特點，使其對MexAB-OprM敏感性較低。通過對比上述報道，β-內酰胺類與氟喹諾酮類藥物的主要外排系統具有差異，單一外排通道被激活不能同時使兩類藥物大量外排，兩類藥物聯合應用，可防止外排通道單次突變導致的耐藥菌株富集擴增。

OprD2孔道是亞胺培南進入PA的特異性通道，Lee等[28]對OprD基因測序結果顯示，OprD基因突變主要是1 bp插入、基因缺失及核苷酸突變形成終止密碼子，可導致OprD2孔道缺失致使PA對亞胺培南產生耐藥。OprD基因突變對其他碳青霉烯類藥物影響較小，只會增加美羅培南的MIC；如出現對二者同時耐藥，往往合并其他耐藥機制，如AmpC酶的大量產生[29]。Livermore[30]同時證明，單一OprD基因突變導致OprD蛋白減少或缺失僅導致PA對亞胺培南耐藥；當與MexCD-OprJ過度表達等氟喹諾酮耐藥機制并存時，PA才同時對喹諾酮類產生耐藥。

以上研究表明，氟喹諾酮類與β-內酰胺類聯合應用可避免單一突變導致的PA耐藥，同時具有更好的治療效果。值得注意的是，相對于耐藥菌株的不斷涌現，新型抗菌藥物的開發與研制進度顯得緩慢。正確選擇與應用抗菌藥，降低細菌選擇壓力，從而減少耐藥菌株的產生已成為今后治療細菌感染的重點。同時，對于單一藥物治療效果差的細菌，如多重耐藥PA等所造成的感染，不應盲目聯合用藥，仍需以藥敏試驗、較為成熟的科研理論所得出結果作為選擇最佳治療方案的指導，更好地控制耐藥菌株的產生及獲得更優的治療效果。

[1] Tamma PD,Cosgrove SE,Maragakis LL.Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria[J].Clin Microbiol Rev,2012,25(3):450-470.

[2] 中華醫學會呼吸病學分會感染學組.銅綠假單胞菌下呼吸道感染診治專家共識[J].中華結核和呼吸雜志,2014,37(1):9-15.

[3] 汪復,朱德妹,胡付品,等.2009年中國CHINET細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志,2010,10(5):325-334.

[4] 朱德妹,汪復,胡付品,等.2010年中國CHINET細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志,2011,11(5):321-329.

[5] 胡付品,朱德妹,汪復,等.2011年中國CHINET細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志,2012,12(5):321-329.

[6] 汪復,朱德妹,胡付品,等.2012年中國CHINET細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志,2013,13(5):321-330.

[7] 胡付品,朱德妹,汪復,等.2013年中國CHINET細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志,2014,14(5):365-374.

[8] 劉向欣,尹素鳳,劉運秋.醫院與社區獲得性肺炎患者病原菌分布及耐藥性分析[J].現代預防醫學,2013,40(23):4469-4471,4474.

[9] Jacobs C.Pharmacia Biotech & Science prize.1997 grand prize winner.Life in the balance:cell walls and antibiotic resistance[J].Science,1997,278(5344):1731-1732.

[10]王美英.超廣譜β-內酰胺酶的生物學特性及其檢測的研究進展[J].河北醫藥,2011,33(17):2667-2669.

[11]Polotto M,Casella T,De Lucca Oliveira MG,et al.Detection of P.aeruginosa harboring bla CTX-M-2,bla GES-1 and bla GES-5,bla IMP-1 and bla SPM-1 causing infections in Brazilian tertiary-care hospital[J].BMC Infect Dis,2012,12:176.

[12]侯佳慧,童郁,費靜嫻,等.銅綠假單胞菌超廣譜β-內酰胺、質粒介導AmpC酶基因分布及流行特征分析[J].檢驗醫學,2012,27(1):39-43.

[13]王杰.中國部分地區碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌耐藥機制及分子流行病學研究[D].浙江:浙江大學,2011.

[14]Aldred KJ,Kerns RJ,Osheroff N.Mechanism of quinolone action and resistance[J].Biochemistry,2014,53(10):1565-1574.

[15]Yang J,Luo Y,Cui S,et al.Diverse phenotypic and genotypic characterization among clinical Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli isolates carrying plasmid-mediated quinolone resistance determinants[J].Microb Drug Resist,2011,17(3):363-367.

[16]Cesaro A,Bettoni RR,Lascols C,et al.Low selection of topoisomerase mutants from strains of Escherichia coli harbouring plasmid-borne qnr genes[J].J Antimicrob Chemother,2008,61(5):1007-1015.

[17]Dahdouh E,Shoucair SH,Salem SE,et al.Mutant prevention concentrations of imipenem and meropenem against Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii[J].ScientificWorldJournal,2014,2014:979648.

[18]Zhao X,Drlica K.Restricting the selection of antibiotic-resistant mutants:a general strategy derived from fluoroquinolone studies[J].Clin lnfect Dis,2001,33(Suppl):S147-S156.

[19]孫恩華,劉明濤,畢少杰,等.美羅培南及頭孢他啶與其他抗菌藥物聯合應用對銅綠假單胞菌耐藥突變選擇窗的研究[J].中華醫院感染學雜志,2011,21(4):631-633.

[20]Zhanel GG,Mayer M,Laing N,et al.Mutant prevention concentrations of levofloxacin alone and in combination with azithromycin,ceftazidime,colistin (Polymyxin E),meropenem,piperacillin-tazobactam,and tobramycin against Pseudomonas aeruginosa[J].Antimicrob Agents Chemother,2006,50(6):2228-2230.

[21]付強,任艷麗,郭華,等.左氧氟沙星聯合頭孢哌酮舒巴坦對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌突變選擇窗的影響[J].中國醫院藥學雜志,2014,34(17):1476-1479.

[22]Fernández L,Hancock RE.Adaptive and mutational resistance:role of porins and efflux pumps in drug resistance[J].Clin Microbiol Rev,2012,25(4):661-681.

[23]Dunham SA,McPherson CJ,Miller AA.The relative contribution of efflux and target gene mutations to fluoroquinolone resistance in recent clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2010,29(3):279-288.

[24]Dreier1 J,Ruggerone P.Interaction of antibacterial compounds with RND efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa[J].Front Microbiol,2015,6:660.

[25]Masuda N,Sakagawa E,Ohya S,et al.Substrate specificities of MexAB-OprM,MexCD-OprJ,and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(12):3322-3327.

[26]Hocquet D,Nordmann P,El GF,et al.Involvement of the MexXY-OprM efflux system in emergence of cefepime resistance in clinical strains of Pseudomonas aeruginosa[J].Antimicrob Agents Chemother,2006,50(4):1347-1351.

[27]Sacha P,Wieczorek P,Ojdana D,et al.Expression of MexAB-OprM efflux pump system and susceptibility to antibiotics of different Pseudomonas aeruginosa clones isolated from patients hospitalized in two intensive care units at University Hospital in Bialystok (northeastern Poland) between January 2002 and December 2009[J].APMIS,2014,122(10):931-940.

[28]Lee JY,Ko KS.Opr D mutations and inactivation,expression of efflux pumps and AmpC,and metallo-β-lactamases in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from South Korea[J].Int J Antimicrob Agents,2012,40(2):168-172.

[29]Arabestani MR,Rajabpour M,Yousefi MR,et al.Expression of efflux pump MexAB-OprM and OprD of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from clinical samples using qRT-PCR[J].Arch Iran Med,2015,18(2):102-108.

[30]Livermore DM.Of Pseudomonas,porins,pumps and carbapenems[J].J Antimicrob Chemother,2001,47(3):247-250.

Research progress on the mechanism of beta lactam combined with fluoroquinolones in the treatment of infection ofPseudomonasaeruginosa

XU Hui,HE Xiao-jing,LI Xiao-bing,JIAN Ling-yan*

(Department of Pharmacy,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Pseudomonasaeruginosaas a Gram-negative bacteria,is the main pathogenic bacteria of nosocomial infection with the characteristics of strong pathogenicity and high fatality rate.Due to the wide use of antibacterial agents in recent years,the resistance rate toPseudomonasaeruginosahas increased significantly.The infection caused by multiple drug-resistantPseudomonasaeruginosahas evolved into a hot and difficult point in clinical treatment. This paper reviews the mechanism of beta lactam combined with fluoroquinolones in the treatment of infection ofPseudomonasaeruginos.

Pseudomonasaeruginosa;Multi-drug resistance;Beta-lactams;Fluoroquinolones;Combination therapy

2017-01-16

中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽 110004

遼寧省自然科學基金項目(2014021090)

10.14053/j.cnki.ppcr.201706027

*通信作者