泛素化修飾在鹽敏感性高血壓發生發展中的分子機制研究進展

袁玉婷

北京大學國際醫院心內科(北京 102206)

·綜 述·

泛素化修飾在鹽敏感性高血壓發生發展中的分子機制研究進展

袁玉婷

北京大學國際醫院心內科(北京 102206)

泛素化修飾在鹽敏感性高血壓發生發展中發揮重要作用，通過參與介導蛋白質降解，調控細胞活動，影響與血清離子代謝相關通道如ENaC、鈉氯共轉運、腎臟外髓鉀離子通道、氯共轉運體的表達與作用，同時還參與動脈硬化、腎小管損傷、高糖所致血管損傷等病變，導致鹽敏感性高血壓發生與發展。

我國高血壓發病率約為20%，因人口平均年齡增長、吸煙人群比率上升等原因，發病率仍呈上升趨勢[1-2]。鹽敏感高血壓是指高鹽攝入后鈉潴留、血壓顯著上升的一類特殊性高血壓，高鹽攝入是血壓上升的獨立危險因素。鹽敏感性高血壓具有其特殊的發病機制、臨床特征，腎素-血管緊張素系統在其中發揮重要作用[3]。泛素是一種由76個氨基酸構成的多肽，廣泛存在于真核生物中，具有高度保守性，泛素化修飾是指泛素分子在系列酶的作用下與蛋白質共價結合的過程，廣泛參與介導蛋白質降解，幾乎調控所有的細胞活動，與人類重大疾病發生、發展關系密切。本次研究試就泛素化修飾在鹽敏感性高血壓發生發展中的分子機制研究進展進行概述。

1 泛素-蛋白酶體系統 泛素化修飾整個過程涉及泛素分子、底物蛋白、多種酶系統、泛素結合酶等，共同構成了泛素-蛋白酶體系統。參與了真核生物體內80%～85%的蛋白質降解，具有ATP依賴、高效、高度選擇性特點，具有標記靶蛋白、轉錄因子活性、逆轉錄病毒出芽、調節胰島素水平、調控TGF-β通路等作用，參與系統基因表達、增殖、分化、衰老、凋亡與自噬，調控個體生長、發育與衰老等生物活動。底物蛋白廣泛存在于細胞內，泛素化修飾因此還能參與DNA損傷修復、免疫應答等生物化學作用。泛素化修飾通過位點實現特異性作用。在鹽敏感性高血壓中，其主要通過參與離子通道、腎素-血管緊張素系統作用，影響鹽敏感性高血壓的發生與變化。

2 泛素化修飾與ENaC 腎臟中，ENaC分布在遠曲小管末端、連接小管和集合管的膜表面，與鈉的重吸收、血壓調控關系密切，是腎素-血管緊張素系統的重要組成部分。前文提到泛素化修飾廣泛參與生物細胞的活動。有證據顯示，ENaC可能與遺傳性高血壓有關，影響鹽敏感性，若出現功能紊亂，則在攝入高鹽后，容易出現離子重吸收障礙，進而導致血壓上升。泛素連接酶E3 NEDD4L家族參與調控ENaC的表達，在維持細胞內外鈉離子平衡方面發揮重要作用。臨床研究證實，Liddle綜合征與ENaC-NEDD4l-蛋白酶體系基因突變有關，一項針對人的基因多態性研究顯示，Nedd4l基因的單核酸多態性與高血壓關系密切。動物實驗研究證實鹽敏感小鼠和鹽抵抗小鼠腎臟遠端小管Nedd4l表達存在顯著差異。另一項動物實驗證實，膜表面NEDD4-2數量受醛固酮水平、鈉鹽飲食影響[4]。O.Staub等發現，Liddle綜合征患者NEDD4-2通過WW結構域與ENaC的PY結構域結合介導ENaC的泛素化修飾，從而加速ENaC細胞活動，加速細胞凋亡，減少表達水平，引起ENaC功能紊亂，最終引起高血壓[5]。基因敲除實驗進一步證實了泛素化特異性修飾對ENac表達的影響[6]。NEDD4-2對EnaC的泛素化作用受激素影響，醛固酮可誘導血清和糖皮質激素參與蛋白激酶的合成，競爭性抑制NEDD4-2與ENac結合，減弱了ENac泛素化修飾。最新的研究發現，ENaC的N端賴氨酸是泛素化、乙酰化的共同位點，組蛋白脫乙酰酶抑制劑曲古抑菌素A能夠糾正α/β/γ-ENaC的乙酰化，增加膜表面EnaC數量，這一發現為靶點藥物的研發奠定了理論基礎。

3 泛素化修飾與鈉氯共轉運體 鈉氯共轉運體(NCC)是影響鹽敏感性高血液的重要物質，位于腎臟遠曲小管影響鈉離子、氯離子的重吸收。NCC基因失活會導致低鈣低鉀性低血壓綜合征，過度激活，則會導致家族性高鉀性高血壓Gordon綜合征。NCC的泛素化修飾主要為泛素連接酶E3,主要受NEDD4-2、KLHL3-CUL3調控。很早學術界便認識到NEDD4-2對NCC存在顯著影響，基因敲除實驗陸續發現了sgk1等定點泛素化修飾對NCC表達影響，體外研究證實激活NEK293細胞，能夠上調NCC表達激活其活性。但目前尚無有關于HECT-E3人體、臨床研究證實NCC與泛素化修飾的具體作用機制研究。國內外陸續報道證實致病基因的突變會導致Gordon綜合征。KLHL3-CUL3泛素連接酶復合靶向作用于WNK激酶后者通過磷酸化激活SPS-1相關的氧化應激反應激酶，磷酸化SPAK-OSR1，從而調控NCC在遠曲小管上的表達。SPAK全基因敲除小鼠、小鼠模型也證實SPAK對NCC的調控作用，SPAK在基因敲出后無法得到有效的補償，提示其在NCC磷酸化、活性調控中發揮關鍵作用[7]。

4 泛素化修飾與腎臟外髓鉀離子通道 腎臟外髓鉀離子通道是一種ATP依賴性鉀離子分泌通道，直接影響鉀離子的分泌，從而影響人體對高鹽飲食的敏感性。研究證實，PHAⅡ高血壓與KLHL3-CUL3泛素連接酶E3復合酶突變關系密切，免疫共沉實驗發現，后者與底物WNK4靶向結合，結合后促網格蛋白介導ROMK細胞內吞，從而抑制腎臟外髓鉀離子通道在細胞膜表面的表達，調節鉀離子分泌。動物實驗證實，對小鼠進行WNK4特異性抗體染色，結果顯示出現WNK4泛素化修飾與降解異常，腎臟外髓鉀離子通道調控市場。需注意的是，目前針對WNK4對腎臟外髓鉀離子通道的抑制作用機制尚未被完成闡明，可能與下游SPAK通路有關。

5 泛素與轉運體 泛素與Na+-K+-2CL-共轉運體(NKCC2)在髓端升支粗段細胞頂端膜中表達，調控Na+、Cl-的重吸收，相關特異性抑制劑已被用于抗高血壓的治療。動物研究證實，高鹽飲食實驗的CYP4F2轉基因小鼠的NKCC2、NEDD4-2結合增加，相較于野生的小鼠，其腎臟NKCC2蛋白表達明顯下降，同時采用20-HETE合成抑制劑可起到糾正作用。Y等較早的一項實驗發現，EEDD4-2是人類NHE3通道的泛素連接酶，在PS120纖維原細胞周利用慢病毒shRNA使Nedd-42基因沉默，結果顯示人類NHE3表達下調，同時動物實驗發現，這種方法不能使小鼠、家兔表達下調。另有實驗發現，rNHF3活性不受shNEDD4-2處理影響。誘導NEDD-4突變，發現其對NHE3泛素化主要依賴于PY結構域，這種結構域僅存在于靈長類動物中，與前文中的小鼠、兔表達不受影響相吻合。高血壓患者為代償性的減少Na+負荷，NHE3通道會從膜表面進行例子重排，NEDD4-2會調節hNHE3的吞噬作用。NHE3的降解影響因素較大，動物研究顯示阿齊沙坦等血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑，相較于空白小鼠、坎地沙坦在切除部分腎后，排鈉量明顯上升，排除曲線顯示阿齊沙坦具有明顯的鈉潴留作用，與此同時其血壓下降更為顯著。動物實驗證實，阿齊沙坦可能通過誘導NHE3表達下調，增加NHE3泛素化水平，提高鈉離子敏感性，從而發揮降壓作用。

6 其 他 前文的研究，主要針對泛素化在離子代謝通道相關調控作用，通過調節吞噬作用，影響表達，從而影響離子代謝，在許多高鹽敏感性高血壓中被檢出泛素化、連接酶相關基因表達異常。泛素化還通過調節細胞周期等作用，參與炎癥反應、高血糖所致腎小管損傷等途徑，影響高血壓的發生、進展。目前，已有許多泛素-蛋白酶體抑制劑用于臨床，并成為防治動脈硬化的重要藥物。這些抑制劑主要包括：①天然的蛋白酶體抑制劑，如乳胞素、3，4-二氯異香豆素(DCI)、PR-30等。以PR-39為例，是一種富含精氨酸/脯氨酸的多肽，具有可逆性；②合成的蛋白酶抑制劑，如肽醛類化合物，如MG132、MG115等，這類化合物選擇性、穩定性差，強度低，但選擇性較高，應用廣，硼酸肽類抑制劑，多為二肽硼酸衍生物，如硼替佐米已被批準用于多發性骨髓瘤的治療。動脈硬化是高血壓的重要原因，與高血壓互為因果，在鹽敏感性高血壓發生、進展中發揮重要作用，研究證實其實血管損傷后炎癥性反應。血管炎癥因子以核因子kB研究最多，NF-kB的活化形式只存在于細胞核提取物種，與其抑制蛋白結合，以穩定的無活性形式存在，當細胞受到外來的刺激時，I-kB激酶被激活，其先被磷酸化、泛素化，而后被降解，快速解離釋放，進而NF-kB易位至細胞核，指導cAMP反應元件和結合蛋白(CREB)和結合蛋白基因轉錄。理論上，通過控制相關磷酸酶，從而調節NF-kB，抑制NF-kB活化，通過抑制I-kB蛋白講解，使的NF-kB無法進入細胞核，從而發揮抗炎作用，抑制動脈硬化。

7 小 結 泛素化參與的細胞生活活動十分復雜，通過直接以及間接作用，影響鹽敏感性高血壓發生、進展、轉歸，已有針對泛素化-蛋白酶體的用于治療高血壓的靶點藥物應用于市場。目前高鹽敏感性高血壓的患者占高血壓患者的比重較低，基因變異引起的高鹽敏感性高血壓分子生物學研究集中在動物模型上。而高鹽飲食高血壓患者較多，高鹽飲食對相關泛素化-蛋白酶體系統的影響較大，相關泛素化-蛋白酶體系統可自適應性的調節相關分子生物通道的功能，從而參與高血壓的發生、進展，這是今后研究的重點。

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(收稿：2017-01-14)

高血壓 @泛素化修飾 分子生物學

R544.1

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10.3969/j.issn.1000-7377.2017.08.081