樺褐孔菌菌質提取物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

李東文 蘇明聲 龍 凱 梁永紅 謝小梅

（1 江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室創新藥物與高效節能降耗制藥設備國家重點實驗室，南昌330004；2 江西中醫藥大學藥學院，南昌330004）

樺褐孔菌學名為Inonotus obliquus（Pers.:Fr.）Pi?lat，又名斜生褐孔菌、白樺茸，是一種珍稀藥用真菌，菌核外形呈現出瘤狀，表面深褐色并有許多深的裂痕，質地硬且脆[1]。樺褐孔菌含有多糖類化合物、芳香物質、葉酸衍生物、多酚類化合物、甾體類化合物和三萜類化合物等多種活性成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和防治糖尿病等多種生理活性[2]。尤其樺褐孔菌在防治糖尿病方面的應用更是受到普遍關注，俄羅斯Komsomlshi 制藥公司生產的樺褐孔菌精粉對糖尿病的治愈率達93%。但目前樺褐孔菌資源匱乏，野生資源日益枯竭，現有的資源量已經滿足不了大量的臨床需求[3]。研究運用雙向固體發酵技術[4]，以樺褐孔菌為發酵菌種，中藥渣為發酵基質，在特定條件下進行固體發酵，獲得了藥性菌質--樺褐孔菌菌質。測定樺褐孔菌菌質不同溶劑提取組分對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性，為實現利用中藥渣的同時獲取具有降糖活性的樺褐孔菌菌質提供實驗依據。

1 材料與方法

樺褐孔菌菌質（簡稱“菌質”，簡寫“JZ”），實驗室自制（自制過程另文發表）。樺褐孔菌菌核（簡稱“菌核”，簡寫“JH”），購自延邊華廈桑黃菌業有限公司，羅永明教授鑒定。

淀粉、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、PNPG 均購于Sigma 公司；阿卡波糖對照品（Solarbio），其余試劑均為國產分析純。UV-2102 型紫外-可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司），DK-8D 型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 活性物質的提取（另文發表） 簡述如下:取樺褐孔菌菌質和菌核粗粉1 kg，按1∶12（g∶mL）的比例分別加入80%乙醇回流提取（1 h/次，提取3 次）。提取液合并后減壓回收溶劑，得乙醇浸膏，將乙醇浸膏混懸于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別減壓回收溶劑，得各萃取組分。取乙醇浸提后的殘渣熱水浸提，提取液濃縮后醇沉得粗多糖。

1.2.2 抑酶活性測定

1.2.2.1 各組分對α-淀粉酶抑制活性的測定 淀粉酶與底物淀粉發生反應生成還原糖，還原糖與DNS 共熱后在過量的NaOH 溶液中被還原生成具有特征吸收峰的橘紅色氨基化合物，在一定的濃度范圍內氨基化合物的吸光度值與α-淀粉酶的活性成正比[5]。

參照文獻[5]改進后的反應體系為:1 mL 的抑制劑（樣品），0.3 mL 的α-淀粉酶溶液（酶活為6 U/mL，用pH6.8，0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液配制），0.4 mL 1%的淀粉溶液（用pH6.8，0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液配制），37℃反應5 min，加1 mL 的DNS 試劑沸水浴10 min，取出冰水冷卻，定容至25 mL，540 nm測吸光度，以阿卡波糖作陽性對照。具體參照表1，空白處用等體積的pH6.8，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液補足。

表1 α-淀粉酶活性抑制體系

1.2.2.2 各組分對α-葡萄糖苷酶抑制活性測定pNPG（4-硝基酚-α-D-吡喃-葡萄糖苷）在α-葡萄糖苷酶作用下水解生成葡萄糖和pNP（對硝基苯酚），pNP在堿性環境下呈黃色在400 nm處有最大吸收[6]。

參照文獻[7]改進后的反應體系為:1 mL 的抑制劑（樣品），0.2 mLα-葡萄糖苷酶（酶活為3.75 U/mL，用pH6.8，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制），0.2 mL pNPG溶液（6 mmol/L 用pH6.8，0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液配制），37℃恒溫水浴30 min，加6 mLNa2CO3溶液（0.1 mol/L）終止反應，400 nm 處測吸光值，以阿卡波糖作陽性對照。具體參照表2進行，空白處用等體積的pH6.8，0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液補足。

表2 α-葡萄糖苷酶活性抑制體系

2 結果與分析

2.1 各組分對α-淀粉酶抑制率根據公式，抑制率/%=（1-A00/A01）×100；A00=A3-A4，A01=A1-A2；式中:A1、A2、A3、A4分別為540 nm 處空白管、空白對照管、樣品管和背景管的吸光值。通過計算菌質、菌核石油醚組分的抑制率為0，其它各組分的抑制率見表3，圖1。

表3 不同組分對α-淀粉酶抑制率（%）

由表3 結合圖1 可清晰看出，菌質和菌核粗多糖對α-淀粉酶抑制率與陽性對照阿卡波糖相比，差異極顯著（P＜0.01），但比相應的乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水層提取物、石油醚提取物的抑制率高，差異極顯著（P＜0.01）；菌核粗多糖對α-淀粉酶的抑制作用比菌質高，差異顯著（P＜0.05）。

2.2 各組分對α-葡萄糖苷酶抑制率根據公式，抑制率/%=（1-A00/A01）×100；A00=A3-A4，A01=A1-A2；式中:A1、A2、A3、A4分別為400 nm 處空白管、空白對照管、樣品管和背景管的吸光值。通過計算菌質、菌核石油醚組分的抑制率為0，其它組分的抑制率見表4，圖2。

由表4 及圖2 可清晰看出，菌質和菌核粗多糖對α-葡萄糖苷酶抑制率與陽性對照阿卡波糖相比，差異極顯著（P＜0.01），但比相應的乙酸乙酯、正丁醇、水層提取物、石油醚的抑制率高，差異有統計學意義（P＜0.01）；菌核粗多糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用比菌質高（P＜0.05）。

圖1 樺褐孔菌菌質和菌核不同溶劑提取組分對α-淀粉酶抑制率隨樣品質量濃度變化趨勢

圖2 樺褐孔菌菌質和菌核不同溶劑提取組分對α-葡萄糖酶抑制率隨組分質量濃度變化趨勢

表4 不同組分對α-葡萄糖苷酶抑制率（%）

3 小結與討論

α-葡萄糖苷酶的抑制劑能夠競爭性抑制小腸上皮絨毛膜刷狀緣上多種酶的活性[8]，α-淀粉酶抑制劑能夠有效抑制腸道內唾液及胰淀粉酶的活性[9]，這兩種酶抑制劑通過調控碳水化合物的降解，延緩葡萄糖在腸道內的吸收，進而降低餐后血糖，是目前進行糖尿病防治比較有效的方法。研究通過測定樺褐孔菌菌質不同溶劑提取組分對這兩種酶的抑制活性，并與菌核進行了比較，結果表明，菌質和菌核粗多糖提取物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有較高的抑制作用。

目前樺褐孔菌降糖作用有效成分的研究主要集中在其水提物和多糖上[10]，還有研究證實其乙酸乙酯（提取）組分能較好的降低四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠的血糖[11]。對比樺褐孔菌菌質和菌核提取各組分對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用，發現不管菌核還是菌質其抑制作用較強的組分均是粗多糖。

可見通過雙向固體發酵技術制得的樺褐孔菌菌質提取物能較好抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，其活性成分的分離鑒定和藥理作用還有待進一步研究。雙向固體發酵技術其工藝簡單，設備要求不高，成本也較低，并能將中藥渣重新開發利用，不僅節約了資源，而且彌補了名貴藥用真菌樺褐孔菌野生資源短缺，為樺褐孔菌資源的來源增添了一條新的途徑，后續將對菌質多糖的降糖作用進一步研究。