非結(jié)構(gòu)蛋白4B與卵巢癌免疫反應(yīng)抗原域蛋白2相互作用結(jié)構(gòu)域的生物信息學(xué)分析

王騫若，郭逢林，徐晶，徐阿慧， 郭韞麗，孔令保, 2

(1江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌330045；2南昌大學(xué)生命科學(xué)院人類衰老研究所)

非結(jié)構(gòu)蛋白4B與卵巢癌免疫反應(yīng)抗原域蛋白2相互作用結(jié)構(gòu)域的生物信息學(xué)分析

王騫若1，郭逢林1，徐晶1，徐阿慧1， 郭韞麗1，孔令保1, 2

(1江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌330045；2南昌大學(xué)生命科學(xué)院人類衰老研究所)

目的分析非結(jié)構(gòu)蛋白4B(NS4B蛋白)與卵巢癌免疫反應(yīng)抗原域蛋白2(OCIAD2)相互作用的結(jié)構(gòu)域。方法進(jìn)入(美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)主頁分別查詢NS4B蛋白和OCIAD2蛋白GenBank序列號,進(jìn)入通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(UniProt)主頁輸入在NCBI中查詢的NS4B蛋白和OCIAD2蛋白序列號，查詢蛋白編號,進(jìn)入ELM主頁面，輸入在UniProt查詢到的NS4B蛋白編號A4GSN1和OCIAD2蛋白編號Q56VL3, 查詢跨膜結(jié)構(gòu)域和線性基序。 返回ELM主頁，選擇ELM binding domains，查詢數(shù)據(jù)庫里總的相互作用結(jié)構(gòu)域。進(jìn)入SMART主頁，輸入蛋白序列號或蛋白序列，查詢蛋白跨膜區(qū)域和低復(fù)雜性區(qū)域。低復(fù)雜性區(qū)域的氨基酸會呈現(xiàn)出彈性的結(jié)構(gòu)容易作為該蛋白和其他類型蛋白相結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。不同的跨膜區(qū)域因共同定位于細(xì)胞膜上可能發(fā)生相互作用。結(jié)果NS4B蛋白存在跨膜區(qū)域，OCIAD2蛋白不存在跨膜區(qū)域，沒有發(fā)現(xiàn)NS4B和OCIAD2蛋白存在直接相互作用的線性基序。OCIAD2蛋白具有一個低復(fù)雜性區(qū)域(88～98氨基酸)；NS4B蛋白具有2個低復(fù)雜性區(qū)域(106～132氨基酸和141～154氨基酸)。結(jié)論OCIAD2蛋白與NS4B蛋白可能通過低復(fù)雜性區(qū)域發(fā)生直接相互作用。

卵巢癌；非結(jié)構(gòu)蛋白4B；含卵巢癌免疫反應(yīng)抗原域蛋白2；生物信息學(xué)

Abstract:ObjectiveTo analyze the interaction domains between nonstructural protein 4B (NS4B) protein and ovarian cancer immuno-reactive antigen domain containing 2 (OCIAD2) protein.MethodsTransmembrane regions and linear motifs were identified by searching the homepage of NCBI (National Biotechnology Information Center) for NS4B protein and OCIAD2 protein GenBank sequence numbers, entering the UniPort (universal protein) home page to input the NS4B protein and OCIAD2 protein sequence numbers obtained in NCBI and to get the OCIAD2 protein number A4GSN1 and OCIAD2 protein number Q56VL3 in UniPort, and then entering the ELM home page to input the NS4B protein number A4GSN1 and the OCIAD2 protein number Q56VL3. Total interaction domains were sought by going to the ELM home page and selecting ELM binding domains. The protein transmembrane regions and the low-complexity regions were identified by entering the SMART home page and entering the protein sequence number, or protein sequence. Low-complexity regions exhibited an elastic structure that readily served as a domain for binding other proteins. Different transmembrane regions bond together because of their colocalization in the cell membrane.ResultsTransmembrane region was present in NS4B protein, but not in OCIAD2 protein. No linear interaction motif between NS4B protein and OCIAD2 protein was identified. OCIAD2 protein had a low-complexity region (88-98 amino acids). NS4B protein had two low complexity regions [(106-132 amino acids) and (141-154 amino acids)].ConclusionOCIAD2 protein and NS4B protein may interact directly through low-complexity regions.

Keywords: nonstructural protein 4B; ovarian cancer immuno-reactive antigen domain containing 2; bioinformatics

非結(jié)構(gòu)蛋白4B(NS4B)蛋白是HCV開放閱讀框架(ORF)編碼的多聚蛋白前體的酶切產(chǎn)物之一，是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，與HCV的傳播及致病性密切相關(guān)[1～6]。含卵巢癌免疫反應(yīng)抗原域蛋白2(OCIAD2)是OCIA超家族中的一員，是評價腫瘤惡化例如卵巢黏液性腫瘤惡化程度的一個非常有用的生物標(biāo)志物[7～12]。前期我們通過串聯(lián)親和層析和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜篩選分析發(fā)現(xiàn)NS4B蛋白和OCIAD2蛋白發(fā)生相互作用。但是，這兩種蛋白是否發(fā)生直接相互作用及其相互作用結(jié)構(gòu)域并不清楚。本研究利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫NCBI、UniProt、ELM和SMART，對OCIAD2蛋白與NS4B蛋白之間的相互作用結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，旨在為后期OCIAD2蛋白與NS4B蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域和相互作用機(jī)制的研究以及相關(guān)抑制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及工具 NS4B蛋白(GenBank序列號為ABO28521.1)、 OCIAD2蛋白(數(shù)據(jù)庫序列號NP_001014446.1)。NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、UniProt (http://www.uniprot.org/)，ELM(http://elm.eu.org/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)數(shù)據(jù)庫及其軟件。

1.2 OCIAD2蛋白與NS4B蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域的生物信息學(xué)分析方法 進(jìn)入NCBI主頁分別查詢NS4B蛋白和OCIAD2蛋白GenBank序列號。進(jìn)入UniProt主頁輸入在NCBI中查詢的NS4B蛋白序列號和OCIAD2蛋白編號，查詢蛋白編碼。進(jìn)入ELM主頁面，輸入在UniProt查詢到的NS4B蛋白編號A4GSN1和OCIAD2蛋白編號Q56VL3。查詢跨膜結(jié)構(gòu)域和基序。返回ELM主頁，選擇ELM binding domains，查詢數(shù)據(jù)庫里總的相互作用結(jié)構(gòu)域進(jìn)入SMART主頁，輸入蛋白序列號或蛋白序列，查詢蛋白跨膜區(qū)域和低復(fù)雜性區(qū)域。低復(fù)雜性區(qū)域的蛋白會呈現(xiàn)出彈性的結(jié)構(gòu)容易作為該區(qū)域的蛋白和其他類型蛋白相結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。不同的跨膜區(qū)域因共同定位于細(xì)胞膜上可能發(fā)生相互作用。

2 結(jié)果

NS4B的GenBank序列號為ABO28521.1，OCIAD2的GenBank序列號為NP_001014446.1。UniProt數(shù)據(jù)庫NS4B蛋白編號為A4GSN1，OCIAD2蛋白編號為Q56VL3，用其在ELM軟件中分別查詢NS4B蛋白和OCIAD2蛋白的二級結(jié)構(gòu)。ELM數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果NS4B蛋白存在跨膜區(qū)域，OCIAD2蛋白不存在跨膜區(qū)域，沒有發(fā)現(xiàn)NS4B和OCIAD2蛋白的線性結(jié)構(gòu)中存在直接相互作用區(qū)域。用SMART軟件查詢結(jié)果顯示OCIAD2蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，存在低復(fù)雜性區(qū)域(88～98氨基酸)；NS4B蛋白存在一個跨膜結(jié)構(gòu)域和2個低復(fù)雜性區(qū)域(106～132氨基酸和141～154氨基酸)。

3 討論

隨著人類基因組測序工作的完成，生命科學(xué)進(jìn)入后基因組和蛋白質(zhì)組時代。蛋白質(zhì)是生命活動的主要執(zhí)行者，但是生明活動中各項功能和行為常常不是由單一蛋白質(zhì)來完成的，需要蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸直接相互作用來實現(xiàn)的[1]。生命活動的各種過程例如DNA的合成、基因轉(zhuǎn)錄激活、蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要的生命過程均涉及到蛋白質(zhì)復(fù)合體的作用[2]。

HCV感染是一個嚴(yán)重的全球性問題，影響到全球人口的3%左右，在感染者中大約20%～30%發(fā)展為慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌等[3]。HCV呈球形，直徑小于80 nm，為單股正鏈RNA病毒，屬黃病毒科[4]。HCV-RNA長9 500～10 000 bp，由5′非編碼區(qū)、3′非編碼區(qū)和一個大的ORF組成[5]。HCV的ORF編碼一個3 000多個氨基酸殘基組成的多聚蛋白前體[6]。該多聚蛋白前體經(jīng)宿主蛋白酶和HCV編碼的蛋白酶切割后產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(core、E1和E2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS4A和NS5B)[7]。HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B由261個氨基酸組成，高度疏水，含有至少4個跨膜區(qū)，是一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合蛋白，該蛋白在病毒生活史及致病性中均發(fā)揮重要作用[8]。

OCIA蛋白是一類存在于真核生物中的保守蛋白，存在多種同源異構(gòu)體形式。OCIA蛋白都含有一個OCIA超家族保守結(jié)構(gòu)域，該保守結(jié)構(gòu)域位于氨基酸序列的N端。OCIAD2是OCIA超家族中的一員，隨著腫瘤的惡化OCIAD2的表達(dá)量也隨之增加，OCIAD2是評價腫瘤惡化例如卵巢黏液性腫瘤惡化程度的一個非常有用的生物標(biāo)志物[9～12]。前期我們通過串聯(lián)親和層析和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜篩選分析發(fā)現(xiàn)NS4B蛋白和OCIAD2蛋白發(fā)生相互作用[13]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NS4B蛋白存在跨膜區(qū)域，OCIAD2蛋白不存在跨膜區(qū)域，沒有發(fā)現(xiàn)NS4B和OCIAD2蛋白的線性結(jié)構(gòu)中存在直接相互作用區(qū)域。SMART軟件查詢結(jié)果顯示OCIAD2蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，存在低復(fù)雜性區(qū)域(88～98氨基酸)；NS4B蛋白存在有跨膜結(jié)構(gòu)域和2個低復(fù)雜性區(qū)域(106～132氨基酸和141～154氨基酸)。這些分析結(jié)果表明NS4B蛋白和OCIAD2蛋白可能通過低復(fù)雜性區(qū)域發(fā)生直接相互作用。

與其他病毒一樣，HCV的復(fù)制過程必須依賴宿主細(xì)胞蛋白，調(diào)控病毒復(fù)制的宿主細(xì)胞蛋白的識別可以有助于闡明病毒復(fù)制的機(jī)制和發(fā)現(xiàn)新的抗病毒靶標(biāo)[13]。而且，與直接靶向病毒的抗病毒藥物相比，靶向宿主蛋白的抗病毒藥物具有廣譜性和不易促使病毒產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)[14]。近些年，隨著HCV復(fù)制子系統(tǒng)、假病毒系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和小鼠感染模型的建立，病毒學(xué)家已經(jīng)可以方便的開展HCV復(fù)制、病毒蛋白翻譯、病毒基因組復(fù)制、病毒粒子組裝和釋放等方面的研究和新的治療藥物的研發(fā)，并取得諸多治療進(jìn)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了參與病毒進(jìn)入、病毒蛋白翻譯、病毒基因組復(fù)制、病毒粒子組裝和釋放的多種病毒蛋白和宿主蛋白，新的直接靶向HCV蛋白的藥物例如fososbuvir獲美國FDA和歐盟批準(zhǔn)，提高了丙肝治愈率(至90%)。但是，HCV的研究和預(yù)防仍然面臨著許多挑戰(zhàn)，例如：病毒復(fù)制及其致病的確切分子機(jī)制任然有待闡明，仍有5%左右(接近1 000萬例)的丙肝患者無法用現(xiàn)有藥物治療，HCV的高度特異性和耐藥性突變，病毒宿主細(xì)胞的復(fù)雜相互作用和宿主遺傳背景的影響等[15]。

近年來，國外多個課題組通過基因沉默和生物信息學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)成功用于調(diào)控HCV復(fù)制的宿主蛋白篩選，已使用靶向全基因組的或者部分基因的siRNA基因沉默表達(dá)，篩選發(fā)現(xiàn)了眾多調(diào)控HCV復(fù)制的宿主蛋白。NS4B是HCV復(fù)制必須的病毒蛋白，因此NS4B為靶標(biāo)的抑制劑成為近年來抗HCV藥物研發(fā)的一個新的熱點(diǎn)[16]。NS4B的寡聚化或膜融合的抑制劑可特異性抑制HCV復(fù)制，提示NS4B自身相互作用及其與宿主細(xì)胞的相互作用參與HCV的復(fù)制，可作為新的抗HCV藥物篩選靶標(biāo)。2012年，我們通過使用生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)NS4B蛋白存在8種蛋白質(zhì)相互作用域和7種共價修飾位點(diǎn)，并構(gòu)建了NS4B蛋白與細(xì)胞蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)[17]。與NS4B相互作用，調(diào)控HCV復(fù)制的宿主的蛋白的識別及機(jī)制闡明對人類進(jìn)一步了解HCV復(fù)制的機(jī)制和新的抗HCV藥物研發(fā)均有重要意義。

近年來，國內(nèi)外對OCIAD2的研究多數(shù)與卵巢癌和肺癌有關(guān)， OCIAD2基因?qū)Ρ尾《镜挠绊懷芯繃鴥?nèi)外均未見報道。本研究通過多種軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)NS4B和OCIAD2可能含通過低復(fù)雜性區(qū)域發(fā)生相互作用，這些預(yù)測結(jié)果為后期OCIAD2蛋白與NS4B蛋相互作用機(jī)制的深入研究和相關(guān)抑制劑研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

[1] 張長勝,來魯華.蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測、設(shè)計與調(diào)控[J].物理化學(xué)學(xué)報, 2012, 28(10): 2363-2380.

[2] 余鑫煜,許正平.蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫及其應(yīng)用[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報, 2008, 24(3): 189-196.

[3] 孫瑞娜,張艷妮,汪俊,等.女貞子抗丙型肝炎病毒復(fù)制酶活性成分研究[J].藥學(xué)學(xué)報, 2013, 48(9):1390-1396.

[4] Lindenbach BD, Rice CM.Unravelling hepatitis C virus replication from genome to function[J].Nature, 2005, 436:933-938.

[5] 鄭義,高博,景維,等.丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B誘導(dǎo)細(xì)胞非折疊蛋白反應(yīng)[J].中國病毒學(xué),2005, 20(4): 374-378.

[6] 熊江紅,張慶華,張艷妮,等.持續(xù)表達(dá)的丙型肝炎病毒NS4B激活HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的研究[J].重慶醫(yī)藥,2012,41(3)524-526.

[7] 孫瑞娜,郭韞麗,汪俊,等.女貞子提取物主要活性組分及其抗丙型肝炎病毒復(fù)制活性分析[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2013,29(10): 956-961.

[8] 張艷妮,張慶華,陳瑤,等.丙型肝炎病毒NS4B蛋白調(diào)控Hep3B細(xì)胞非折疊[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,34(1):165-169.

[9] Ishiyama T, Kano J, Anami Y, et al. OCIA domain containing 2 is highly expressedin adenocarcinoma mixed subtype withbronchioloalveolar carcinoma component andis associated with better prognosis.[J]. Cancer Sci, 2007,98(3):55-57.

[10] Jemal A,Siegel R. Cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2008,58(2):71-76.

[11] Ishiyama T, Kano J, Anami Y, et al. OCIA domain containing 2 is highly expressed in adenocarcinoma mixed subtype with bronchioloalveolar carcinoma component and is associated with better prognosis[J].Cancer Sci，2007，98(1): 7-50.

[12] Nagata C,Kobayashi H, Sakata A, et al.Increased expression of OCIA domain containing 2 during stepwise progression of ovarian mucinous tumor[J]. Pathol Intern, 2012，62(7):471-476.

[13] Li S, Kong L, Yu X, et al. The expanding roles of endoplasmic reticulum stress in virus replication and pathogenesis[J]. Crit Rev Microbiol, 2015,41(2):150-164.

[14] Berger KL, Cooper JD, Heaton NS, et al. Roles for endocytic trafficking and phosphatidylinositol 4-kinase III alpha in hepatitis C virus replication[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009,106(18):7577-7582.

[15] Kong LB,Fujimoto A, Nakamura M, et al. Prolactin regulatory element binding protein is involved in hepatitis C virus replication compartment by interacting with NS4B[J]. J Virol，2016，90(6):3093-3111.

[16] Dvory-Sobol H, Pang PS, Glenn JS, et al. The future of HCV therapy: NS4B as an antiviral target[J].Viruses,2010， 2(11):2481-2492

[17]Li S, Yu X,Guo Y, et al. Interaction networks of hepatitis C virus NS4B: implications for antiviratherapy[J]. Cell Microbiol， 2012,14(7)：994-1002.

Bioinformatics analysis of interaction domain between NS4B protein and OCIAD2 protein

WANGQianruo1,GUOFenglin,XUJing,XUAhui,GUOYunli,KONGLingbao

(1CollegeofBioscienceandEngineering,JiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang330045,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.002

R737.9

A

1002-266X(2017)35-0005-03

2017-02-15)

國家自然科學(xué)基金項目(31460667)；江西省重點(diǎn)研發(fā)計劃項目(20161BBF60084)。

王騫若(1993-)，女，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主要研究方向為分子病毒學(xué)。E-mail：297275662@qq.com

孔令保(1972-)，男，醫(yī)學(xué)博士，副教授，主要研究方向為分子病毒學(xué)。E-mail：lingbaok@hotmail.com