微環境中不同因素對肺癌干細胞影響的研究進展

唐為安，徐興祥，楊俊俊

(1中南大學湘雅二醫院，長沙 410075；2江蘇省蘇北人民醫院)

·綜述·

微環境中不同因素對肺癌干細胞影響的研究進展

唐為安1，徐興祥2，楊俊俊2

(1中南大學湘雅二醫院，長沙 410075；2江蘇省蘇北人民醫院)

肺癌干細胞(LCSC)是一小群具有不斷自我更新和分化能力的腫瘤細胞，微環境是指其鄰近的細胞及其分泌的細胞因子。微環境和LCSC作用機制十分復雜，二者相互促進又相互拮抗，微環境中炎性因子、低氧、新生血管、細胞外基質等因素能夠促進或抑制LCSC的干細胞性。

肺癌；干細胞；微環境；炎性因子；低氧；新生血管；細胞外基質

肺癌干細胞(LCSC)是一小群具有不斷自我更新和分化能力的腫瘤細胞，以往研究多集中于LCSC本身，隨著研究的深入，發現微環境是維持LCSC狀態和功能的重要條件。LCSC微環境是指其鄰近的細胞及其分泌的細胞因子。正常干細胞由微環境“干細胞龕”維持干細胞狀態，LCSC也需要一個特殊的微環境進行調控。微環境和LCSC作用機制十分復雜，二者相互促進又相互拮抗。許多研究表明，微環境中炎性因子、低氧、新生血管、細胞外基質等因素影響LCSC，它們不僅可以直接促進普通腫瘤細胞向LCSC轉變，還能使非腫瘤干細胞向LCSC轉變。研究微環境中不同因素影響LCSC的機制，就能在抑制肺癌生長和轉移方面提高效率[1]。現就微環境中不同因素對LCSC影響的研究進展進行綜述。

1 炎性因子

許多臨床實驗研究已證實炎癥是腫瘤發生的有利條件，而炎癥對LCSC的作用機制則是目前腫瘤研究的新領域。在LCSC微環境中存在各種類型的免疫細胞，這些免疫細胞經過LCSC誘導達到微環境后，分泌大量的細胞炎性因子如IL-6、IL-8、TGF-α等，影響LCSC增殖和分化，維持LCSC不斷自我更新的能力。

1.1 腫瘤相關巨噬細胞(TAM) 在腫瘤發展的早期，TAM是最主要的炎癥細胞，包括經典活化M1型和替代活化M2型。M1型具有分泌多種炎性因子的功能，M2型功能與M1型相反，具有抗炎的作用。Jinushi等[2]發現，M1型TAM能夠釋放乳脂肪球表皮生長因子Ⅷ9(MFG-E8)調節LCSC的活性，MFG-E8能通過激活LCSC中STAT-3和Sonic Hedgehog通路提升LCSC的致瘤性和藥物抵抗，且MFG-E8在炎性因子IL-6的存在下能夠進一步提升LCSC耐藥性。M2型TAM在LCSC的形成中具有獨特的作用。Huang等[3]發現，M2型TAM可通過黏蛋白1(MUC1)誘導LCSC形成并維持其干細胞性。

1.2 IL-6 IL-6是一種多效性前炎癥細胞因子，由多種免疫細胞分泌，并且在多種炎癥反應中高表達。IL-6過表達可以誘導肺間充質干細胞轉化為LCSC[4]。IL-6對LCSC生長與增殖也起啟動作用。Lee等[5]從A549、H157、H1299非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系分離出CD133+和CD133-細胞亞群，分析IL-6對細胞生長轉移能力和上皮-間質轉化(EMT)的影響，發現敲除IL-6的CD133-細胞并沒產生明顯改變，但是敲除IL-6的CD133+細胞自我更新能力明顯低于對照CD133+細胞，可見IL-6對于CD133+細胞生長具有啟動子作用，敲除IL-6導致LCSC細胞生長遲緩。IL-6的表達伴隨著一些特殊蛋白的升高，有研究顯示在慢性炎癥中IL-6的表達伴隨著CXCR4的表達上升。CXCR4是一個7次跨膜的G蛋白偶聯受體，可通過上調CYP1B1來提升非小細胞肺癌患者的化療抵抗性。Tu等[6]發現非小細胞肺癌轉移的患者中IL-6和CXCR4水平較無轉移的患者顯著升高。

1.3 活性氧(ROS) 活化的免疫細胞能夠不斷產生ROS，ROS可直接作用于DNA導致損傷，導致肺部正常干細胞發生基因突變形成LCSC。細胞內的ROS能夠激活對氧化還原反應敏感的轉錄因子，促進腫瘤的形成[7]。目前很多研究發現，ROS促進LCSC侵襲和轉移，但持續高強度的ROS有助于殺傷LCSC。ROS誘導的半胱氨酸S-谷胱甘肽化是控制細胞內許多蛋白質翻譯后修飾活性的重要產物，ROS可以通過S-谷胱甘肽化調節LCSC的形成。Wang等[8]通過LBL21消耗A549細胞內谷胱甘肽(GSH)，導致線粒體呼吸和跨膜電位降低，線粒體功能障礙和ROS積累，結果A549細胞表現出細胞中側群細胞比例降低和干細胞標志物Oct-4、SOX-2、CD133表達下降，可見通過高表達ROS能夠抑制A549細胞內干細胞的生成。

2 低氧

腫瘤細胞增殖需要消耗大量的氧，低氧環境是腫瘤組織普遍存在的現象。低氧是LCSC微環境的重要特點[9]。在缺氧條件下，腫瘤細胞為了緩解大量增殖的壓力，不斷改變自身表型并向遠處轉移，容易導致基因突變和LCSC的形成。

2.1 轉錄因子Oct-4 LCSC多位于缺氧區域，細胞可能通過去分化來逃避缺氧持續存在時的壓力，獲得干細胞性。傳統研究表明，Oct-4在肺部正常細胞中不表達，說明肺組織發育成熟，但是缺氧促進Oct-4在腫瘤細胞中表達，在缺氧刺激下Oct-4激活并重新編程肺癌細胞，促進肺癌細胞的去分化。缺氧條件下的肺癌細胞中Oct-4高度表達，誘導了細胞不規則分裂和細胞周期停滯。在肺腺癌細胞中過表達Oct-4能夠誘導LCSC的形成，可見由缺氧引起的去分化過程很可能是LCSC形成的關鍵[10]。Oct-4還可以誘導肺癌細胞的EMT，促進腫瘤細胞的轉移和干細胞性的形成。Oct-4的陽性表達與E-cad異常表達有關，而E-cad被認為是腫瘤抑制因子，Oct-4激活導致的E-cad下調或缺乏可誘導EMT，導致腫瘤細胞的侵襲和轉移，影響LCSC的形成。除了物理上的低氧處理，化學低氧處理的方法也能夠提高普通細胞的干細胞性。Wang等[11]發現，低氧模擬劑氯化鈷可以提升A549細胞的腫瘤干細胞性。可見Oct-4作為缺氧刺激因子促進肺癌細胞去分化過程，并誘導LCSC的形成。

2.2 低氧誘導因子(HIF) HIF是一種具有轉錄活性的核蛋白，是由120 kD的HIF-1α和91～94 kD的HIF-1β兩個亞單位組成的異源二聚體，對于LCSC的功能具有調控作用。在缺氧條件下缺氧誘導因子HIF-1α與HIF-2α激活并維持LCSC的干細胞性，HIF上調SOX-2和Oct-4等干細胞基因獲得多能性[12]。HIF激活下游基因促進腫瘤細胞的未分化狀態，如HIF-2α所激活的原癌基因(c-Myc)是保證腫瘤干細胞始終處于未分化狀態所必須的[13]。Sun等[14]發現，LCSC的形成常伴有HIF的升高，通過無血清培養篩選出具有干細胞性質的CD133+的A549細胞，其HIF-2α的表達水平明顯高于CD133-細胞，HIF抑制劑FM19G11能夠明顯抑制LCSC干細胞標記物的上調和LCSC的成球能力。低氧加速了腫瘤的惡性轉變，HIF的激活有利于維持LCSC干細胞活性，導致腫瘤組織耐藥性的增強。Zhang等[15]發現，HIF在化療誘導的LCSC中大量上調，并且與IL-6密切相關；其機制可能是IL-6通過轉錄控制HIF并且抑制HIF降解，增強LCSC的耐藥能力。高表達HIF-2α的患者往往在臨床上具有更差的臨床分期和預后，HIF-2α的表達導致癌胚抗原在放療后上升更快，患者的生存期更短。低氧是促進LCSC生成和分化的獨立因素，可誘導出癌細胞的干細胞性，提升其藥物抵抗，并且可導致更差的預后[16]。低氧作為腫瘤發展的必經之路，能夠篩選有更強存活能力的LCSC，促進LCSC分泌更多的血管生成因子促進腫瘤的增殖和轉移。

3 新生血管

腫瘤組織新生血管在腫瘤生長、轉移和干細胞性維持等過程中起重要作用，血管不僅為腫瘤的生長提供營養，并且可為腫瘤轉移提供許多有利條件[17]。在腫瘤生長初期，腫瘤組織無血管生成能力，主要通過炎癥激活核因子NF-κB信號通路促進腫瘤血管生成，腫瘤巨噬細胞通過激活TGF-β、PDGF等細胞因子促進新生血管的形成。

3.1 內皮細胞 血管內皮細胞是血管組成的基本成分，盡管大多數構成血管的細胞來源于內皮細胞，但是一小部分構成血管的細胞可以由LCSC直接分化，從而促進腫瘤新生血管的形成。LCSC通過模擬腫瘤血管，分化為血管內皮細胞，或者直接作用于內皮細胞，誘導新生血管內皮細胞的形成[18]。血管內皮細胞表面存在特定的一組生長因子稱為血管分泌因子，可以通過旁分泌方式促進LCSC的不斷更新和分化，參與誘導維持體內平衡和代謝，因此LCSC常處于內皮細胞覆蓋的成熟血管附近。Wang等[19]通過肺內皮細胞與腸道細胞共培養發現，肺內皮細胞能夠刺激正常細胞中干細胞數量的比例，提高細胞中Nanog和Oct-4等干細胞標記蛋白的表達。另有研究發現，內皮細胞通過Oct-4促進腫瘤血管的新生。Gu等[20]研究發現，多能轉錄因子Oct-4的過表達足以誘導小鼠祖細胞的轉化，這些轉化的細胞不僅具有腫瘤發生和耐藥潛能，還顯著表達一些促血管生成因子，參與腫瘤血管生成。內皮細胞促進正常細胞轉化為LCSC的機制很可能與胚胎干細胞基因Nanogp8的表達有關，內皮細胞通過旁分泌AKT誘導Nanogp8表達和干細胞球形成，調節細胞的表型和藥物抵抗作用。可見LCSC能夠分化為血管內皮細胞，而血管內皮細胞又能夠促進LCSC的形成。

3.2 Dickkopf-1(DKK1) 血清DKK1是Dickkopfs家族成員之一，通過競爭性地結合Wnt蛋白的共同受體而阻斷Wnt/β-catenin途徑，是Wnt信號通路抑制劑。有多重分化和自我更新能力的間充質干細胞(MSCs)常常表達DKK1，使得LCSC周圍血管新生，并致使LCSC細胞產生免疫豁免，避免免疫細胞對LCSC的攻擊。DKK1不僅促進腫瘤周圍血管的新生，還可以提升腫瘤細胞的干細胞性。Yao等[21]通過對28例具有新生血管的非小細胞肺癌患者檢測發現，其LCSC相關蛋白CD44的表達升高，且與分泌型蛋白DKK1密切相關。DKK1促進了LCSC周圍血管的新生，并且提升了普通腫瘤細胞的干細胞活性，通過下調LCSC中的DKKI，能夠明顯抑制腫瘤新生血管的生成以及LCSC標記物的表達。

雖然目前抗腫瘤血管藥是LCSC治療新方向，但如今抗腫瘤新生血管藥物并不是十分完善。抗腫瘤血管生成藥內皮他丁可以拮抗腫瘤新生血管的形成，但通過在移植瘤小鼠模型中使用內皮他丁，發現ALDH1+細胞在實體瘤中的比例增高。內皮他丁導致腫瘤組織缺氧，激活低氧基因如HIF-1α等，并吸引TAM、骨髓來源的抑制性細胞(MDSCs)、T細胞等免疫細胞產生大量的炎癥介質，最終導致腫瘤組織中LCSC的形成[22]。腫瘤新生血管對于LCSC的作用日益受到重視，研究LCSC新生血管的機制有助于我們了解腫瘤轉移、浸潤等機制，為以后抗腫瘤藥物的治療和早期診斷提供指導。

4 細胞外基質

細胞外基質是由細胞分泌于細胞表面的大分子物質，主要由基底膜和細胞間基質組成。細胞外基質將細胞連為一個整體，決定細胞的形狀，控制LCSC的分化與自我更新，并參與LCSC的增殖和侵襲。基質金屬蛋白酶是最重要的一種細胞外基質降解酶，膠原蛋白是基質的重要成分，二者都參與LCSC的發病。

4.1 基質金屬蛋白酶10(MMP-10) MMP-10是基質金屬蛋白酶家族的成員，通過降解細胞外基質幫助腫瘤侵襲和轉移。研究發現，MMP-10不僅與LCSC的干細胞性密切相關，并且對于LCSC的增殖能力必不可少。Justilien等[23]發現，MMP-10在人肺部腫瘤中大量表達，并且其高表達與人類肺癌的干細胞性和腫瘤轉移特征相關，通過敲除小鼠LCSC的MMP-10導致LCSC干細胞標記基因表達、轉移能力和自我更新能力下降，而加入外源性的MMP-10能夠增強MMP-10敲除的LCSC細胞自我更新能力。MMP-10促進腫瘤組織的形成，維持LCSC高致瘤性和干細胞性。MMP-10的表達調控機制目前不清楚，有研究顯示，MMP-10的激活與癌基因Kras基因相關。Regala等[24]研究發現，在肺腺癌小鼠模型中激活癌基因Kras導致MMP-10大量表達，而敲除小鼠體內的MMP-10后再次激活癌基因Kras則發現腫瘤數量和大小顯著降低，表明Kras對于MMP-10誘導的LCSC形成中具有重要作用。

4.2 膠原蛋白 膠原蛋白是結締組織的一種常見蛋白，大多由成纖維細胞分泌，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，是細胞基質的重要成分。膠原蛋白可以促進LCSC的干細胞性。Xu等[25]用3D膠原蛋白支架對肺癌細胞進行培養，在此培養系統中的肺癌細胞其LCSC相關基因如ALDH1、Oct-4、CD133表達水平增高，細胞轉移能力和致瘤性增強，并且具有更強的耐藥性。膠原蛋白不僅可以維持和提升普通腫瘤細胞的干細胞性，而且能夠促進LCSC的轉移和侵襲能力。Moilanen等[26]發現，LCSC中各種黏附分子表達增加，在這些分子中膠原蛋白(Col XVⅡ)被證明是維持LCSC中EMT和轉移能力所必需的，Col ⅩⅤⅡ不僅促進細胞的惡性變化，臨床研究還發現過表達Col ⅩⅤⅡ和層黏連蛋白-5的肺癌手術切除患者具有所有表達類型中最差的預后，通過阻斷Col ⅩⅤⅡ/層黏連蛋白-5途徑可降低LCSC體外EMT和轉移能力。Col ⅩⅤⅡ和穩定的層黏連蛋白-5激活FAK/AKT/GSK3β抑制細胞內泛素化降解，其功能主要取決于ADAM9和ADAM10的脫落。細胞黏附是LCSC遷移的重要條件，一些細胞外基質成分能夠維持LCSC干細胞性，改變LCSC表面的細胞外基質對于LCSC的診斷和治療都具有積極作用。膠原蛋白作為干細胞的一個細胞外屏障，可以增強其耐藥性，并且可以和很多細胞因子如TGF-β、VEGF、BMP等結合，調節LCSC的活性[27]。

微環境影響著LCSC的功能，對LCSC遷移、增殖以及耐藥性都具有不可忽視的作用。近年來關于LCSC微環境的研究越來越受到重視，雖然人們對LCSC微環境的形成、發展和調控都做了進一步的探索，但目前人們對于LCSC微環境的認識不夠全面。微環境對于LCSC的調控是一個復雜又動態的過程，了解微環境各種因素的功能有助于人們更清楚地認識肺癌，控制微環境因素可以為肺癌未來的診斷治療提供新方向和手段。

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國家衛生和計劃生育委員會行業專項(w2014GJ18)。

徐興祥(E-mail： xuxx63@sina.com)

2017-06-27)