急性白血病微小殘留病檢測方法臨床應用的研究進展

王衛國

(阜陽市人民醫院，安徽阜陽 236001)

急性白血病微小殘留病檢測方法臨床應用的研究進展

王衛國

(阜陽市人民醫院，安徽阜陽 236001)

急性白血病(AL)患者治療后微小殘留病(MRD)水平直接決定AL復發和患者的生存期。近年來，越來越多的方法用于MRD的檢測，如熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈式反應(PCR)技術、流式細胞術(FCM)、質譜技術，其預測疾病復發、評估預后等臨床價值得到廣泛認可，可為AL的臨床干預治療提供依據。

急性白血病；微小殘留??；熒光原位雜交；聚合酶鏈式反應；流式細胞術；質譜技術

急性白血病(AL)是發生于造血干細胞水平的惡性腫瘤，按腫瘤細胞的分化系別不同，一般可分為急性髓細胞性白血病(AML)和急性淋巴細胞白血病(ALL)。AL患者治療后體內殘留的腫瘤細胞數量決定其臨床結局。微小殘留病(MRD)是指AL誘導化療或骨髓移植后，達到臨床和血液學的完全緩解(形態學檢查骨髓中原始細胞<5%)，而體內殘存微量白血病細胞的狀態，是病情動態觀察不可或缺的一部分。因此，監測AL患者MRD的變化非常重要。近年來，檢測MRD方法不斷發展，有熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈式反應(PCR)技術、流式細胞術(FCM)、質譜技術?，F將其臨床應用的研究進展進行綜述。

1 FISH

FISH是利用核酸探針在高分辨率中期或間期染色體上雜交，檢測染色體異常的一種方法，檢測MRD的靈敏度為1%左右，但若與其他技術聯合，也可以是一種選擇。Wang等[1]采用一種獨特的Flow-FISH方法分析白血病干細胞的比例：對初診的AML患者利用流式細胞儀分選出CD34+細胞，結合初診時遺傳學的異常結果，對分選細胞進行FISH，鏡檢分析FISH+CD34+CD38-細胞(白血病干細胞)的比例，發現高比例白血病干細胞(>1%)是患者2年總生存率(OS)、無事件生存率(EFS)不利因子。由于白血病干細胞的殘存是AL復發的根本原因，這提示富集白血病細胞后再利用FISH檢測MRD，可能是一種較好的選擇。

2 PCR技術

2.1 融合基因檢測 融合基因是指兩個或兩個以上的基因編碼區首尾相連而形成的嵌合基因。目前AL被檢測最常見的融合基因包括BCR-ABL、RUNX1-RUNX1T1、PML-RARα、TEL/AML1等，檢測方法為逆轉錄PCR、多重PCR或實時定量PCR。酪氨酸激酶抑制劑是治療慢性粒細胞白血病(Ph染色體是其標志性染色體)的首選靶向藥物，但有1/4～1/3的B細胞ALL患者也伴有Ph染色體或BCR-ABL融合基因。這類患者一般預后差，以往首選的治療方案是骨髓移植。Ravandi等[2]對Ph+ALL患者采用酪氨酸激酶抑制劑聯合化療方式進行強化治療，監測包含BCR-ABL在內的骨髓MRD水平，發現患者若能獲得首次完全緩解則可以受益于這種強化治療。現在很多臨床治療中心采用酪氨酸激酶抑制劑聯合化療方案治療Ph+ALL患者，該方案與骨髓移植的療效差異并不明顯[3]，其中MRD的檢測為臨床治療方法的更新提供了強有力的支持。伴有染色體t(8；21)AML的融合基因為RUNX1-RUNX1T1，此類型AML治療效果較好。伴t(8；21)AML患者異基因造血干細胞移植后，12個月內RUNX1-RUNX1T1轉錄本水平比診斷時下降小于3個對數級和(或)12個月后下降小于4個對數級預示著復發[4]。對兒童t(8；21)AML患者的研究也表明，1個療程誘導緩解后RUNX1-RUNX1T1轉錄本下降是否大于2個對數級是影響無復發生存的獨立預后因素[5]?？梢?，融合基因的水平及其轉錄本下降的水平能提前預測AL的復發，為提前的臨床干預提供依據。

2.2 癌基因檢測 AL患者重現性分子及遺傳學異常出現頻率較低，但一些癌基因如腎母細胞瘤基因1(WT1)、腦和AL胞質蛋白(BAALC)基因等會因異常活化而表達增強。WT1為AL患者較常見的過表達癌基因[6,7]，利用實時定量PCR技術檢測其分子表達水平，可反映MRD水平。Lambert等[8]研究發現，誘導治療后和療程結束時外周血WT1 MRD陽性(>0.5%)與較高的復發率和較短的OS有關。PML-RARα表達水平是監測急性早幼粒細胞白血病MRD的標志物，其陽性意味著疾病復發，不能當作預示復發的指標。Yoon等[9]研究發現，維持治療后第3個月高表達WT1(>120 copies/104ABL1)的急性早幼粒細胞白血病患者，具有較高的復發率和較低的無病生存期，多因素分析顯示診斷時高白細胞數量和維持治療后第3個月WT1高表達是預示復發的重要因素?？梢娨訵T1的表達水平來監測MRD評估患者預后是一種可行的方式。AL患者BAALC表達升高可促進白血病細胞的形成，Weber等[10]用實時定量PCR技術檢測正常核型AML患者BAALC轉錄本的表達，發現高表達BAALC與多種預后不良的基因突變有關，是預后不佳的獨立影響因子，可作為一種預后風險分層和MRD監測的標志物。

2.3 基因重排檢測 ALL患者除了BCR/ABL融合基因陽性率在20%～30%外，其他融合基因陽性率均較低。當前許多研究證明免疫球蛋白(Ig)或T細胞受體(TCR)基因重排是ALL細胞克隆性的分子標志，是ALL患者MRD監測應用最廣泛的指標。目前檢測Ig/TCR基因重排國際公認的的方法是標準化BIOMED-2 PCR，利用107對不同引物進行PCR擴增，對電泳結果陽性的標本進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，并再通過測序分析進行驗證。但這種方法繁瑣且成本過高，一般臨床大多利用特異性引物擴增目的片段如等位基因特異性引物PCR法進行檢測[11]。為了提高檢測的靈敏度，Logan等[12]利用下一代高通量測序技術定量檢測ALL患者Ig/TCR重排，認為只要樣本充足，檢測MRD敏感度可達到1×10-6，發現骨髓移植前30 d內MRD≥1×10-4與移植后的復發率有關，17例患者移植后任何時間檢測到MRD≥1×10-6都復發并且死亡，這種分子水平檢測到的MRD比臨床復發提前89 d(中位數)，這種高靈敏度檢測MRD技術能為患者復發前提供一個明確的臨床干預窗。Mannis等[13]也使用下一代測序技術檢測ALL患者自體干細胞移植后外周血MRD水平(Ig/TCR重排)，以探討MRD水平與復發的關系，多變量分析結果顯示，僅MRD≥1×10-6是ALL復發的獨立預測因子?？梢灶A見，隨著技術的完善，下一代測序技術檢測MRD的性能會越來越好，可為臨床治療提供更早更準確的評估信息。

2.4 基因突變檢測 重現性融合基因表達僅出現在較少的AML亞型中，但基因突變是較常見的分子生物學改變，與AML的發生關系密切，是AML危險分層的指標[14,15]。由于技術上的難度，目前臨床上以檢測核磷蛋白1(NPM1)突變的MRD最為常見。鎖核酸(LNA)是一種經過修飾的RNA，其2′和4′的碳連接在一起，因此若在PCR中使用含LNA的引物，反應的穩定性會增加。Shayegi等[16]采用引物中含LNA的實時定量PCR技術檢測具有NPM1突變(NPM1mut)AML患者的MRD：依據最大約登指數對應的臨界值，NPM1mut/ABL1為1%時具有最佳靈敏度和特異度(首次完全緩解后第90天的監測點)；通過交叉驗證部分似然函數推出，化療后NPM1mut/ABL1>1%最能預測復發，而骨髓移植后NPM1mut/ABL1>10%最能預測復發，并與患者的無病生存率和OS有關，提示使用該方法檢測這類患者MRD可為臨床的早期干預治療提供依據。趙婷等[17]研究也表明，NPM1突變陽性的AML患者，伴FLT3-ITD突變和化療后早期MRD高水平提示預后不良。

3 FCM

白血病相關免疫表型(LAIP)是指正常的外周血和骨髓細胞不表達或表達比例低的免疫表型，主要的LAIP包括異位性抗原表達、跨系表達、跨期表達、抗原表達熒光強度異常、散射光異常等，這是FCM檢測MRD的基礎和原理。CD304是漿細胞樣樹突細胞的表面標志，其在B-ALL細胞可出現較強的跨系表達。研究[18]發現，兒童B-ALL患者白血病細胞CD304的陽性表達與短生存率有關，提示CD304表達也許是一種預后不良的因子。CD123在正常造血干細胞為低或不表達，但在白血病細胞上表達增高，且是白血病干細胞的標志之一，AML細胞表達CD34/CD123/CD25/CD99與FLT3-ITD突變密切相關[19]。CD66c是CEA基因家族成員，在血細胞中主要表達于粒細胞，但在BCR/ABL1陽性的B-ALL細胞上也可出現較高表達頻率，并對監測MRD具有較高的診斷價值[20]。

隨著多色流式細胞儀的發展，FCM檢測MRD的準確性和靈敏度均有提高。Weng等[21]利用八色FCM分析了成人B-ALL的MRD：對BCR-ABL陽性的患者，MRD定量采用FCM和實時定量PCR技術，比對分析發現兩種方法具有較好一致性(符合率可達到89.7%)；誘導化療結束時完全緩解及經過1次鞏固治療的患者，若FCM檢測MRD陰性(MRD<0.01%)預示著更佳的2年無復發生存率和OS，MRD為0.001%～0.01%的患者較檢測不出MRD的患者有較高的2年復發率；多變量分析顯示，誘導和1次鞏固治療后MRD陽性(MRD>0.01%)與復發高風險有關，1次鞏固治療后MRD陽性預示較差的OS。八色FCM檢測MRD是一種較靈敏的手段，并能評估臨床預后，也是FCM檢測MRD的一個發展方向。

掌握正常血細胞中不同抗原在不同分化階段的表達量和表達規律、辨別出AL細胞出現的LAIP類型、確定隨訪的抗體組合是FCM檢測MRD的關鍵。一項多中心聯合利用FCM檢測AML MRD研究顯示[22]：在學習和培訓后的檢測階段，每個中心會有一定程度的LAIP錯失，提示LAIP的確定和識別對FCM檢測MRD極其關鍵。另一項5個中心參與的研究結果顯示[23]：在歐洲方案的基礎上，優選出八色方案檢測B-ALL患者的白血病細胞，可以區分出99%患者的異常細胞；與實時定量PCR檢測MRD結果比較，兩者呈明顯的正相關，若能收到足夠的細胞，可以達到與實時定量PCR相似的靈敏度?？梢娎肍CM檢測AL MRD需要優化方案并標準化，并加強對檢測者的培訓。

FCM監測MRD對患者的療效判斷、復發風險評估等有重要作用，并且對移植后的結局預示也非常有價值。Bar等[24]采用FCM監測MRD，發現MRD對ALL患者清髓造血細胞移植的疾病結局有影響：移植前MRD陽性患者具有更高的復發風險；若移植后MRD陽性，患者的復發和死亡風險增加；聯合分析移植前后MRD的影響，MRD均陰性患者復發和死亡風險最低，可見FCM對移植AL患者的預后評估提供了有效手段。丁喆等[25]也利用FCM檢測成人Ph染色體陰性B-ALL的MRD水平，結果也表明自體造血干細胞移植前和治療過程中MRD陰性，患者可以獲得更好的結局。

4 質譜技術

質譜技術是通過測定樣品中被離子化的離子質荷比(m/z)，以實現對樣品的定性和定量，是蛋白質組學研究的支撐技術之一?；|輔助激光解吸飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)具有較高的靈敏度、精密度，在醫學科研中應用較多。Song等[26]利用MALDI-TOF MS分析發現，m/z為4 625的多肽在初治的AL患者中表達高于對照組和非惡性血液病組，并隨著治療后緩解程度的增加而下降；患者獲得分子學緩解時，m/z為4 625的多肽峰信號強度與健康對照者相似并明顯低于復發患者，且m/z為4 625多肽高水平的患者比低水平患者OS低；可見m/z為4 625的多肽可用于AL患者MRD水平監測和提供預后信息。Bai等[27]利用MALDI-TOF MS獲取成人AML患者血清多肽圖，發現：快速分類診斷模型尋找出3種敏感性和特異性俱佳的指標，分別為泛素樣修飾激活酶1(UBA1)、纖維蛋白原α鏈前體異構體1和血小板第四因子(PF4)；UBA1水平在初診、難治性或復發的AML患者中升高，但纖維蛋白原α鏈前體異構體1和PF4水平在這兩者中變化方向與UBA1相反；UBA1表達相對強度高的AML患者生存期較低，纖維蛋白原α鏈前體異構體1和PF4表達相對強度增高的患者具有較高的OS，由此推測這3種肽能用于MRD檢測和臨床預后的評估。質譜技術的應用為AL患者檢測MRD開辟了新的方向和思路。

新的技術和方法的應用，使AL患者MRD檢測更加敏感和準確，但目前也有一些問題有待解決：FISH敏感度低、探針價格昂貴并且應用范圍??；PCR技術敏感度高，但融合基因、基因重排或突變并不普遍存在，且分子生物學檢測的標準化問題也有待解決；FCM檢測優勢是適用范圍廣，但結果受到設門方式、抗體組合的選擇、檢測者經驗等影響，不同實驗室間檢測結果差異較大，在國內尤其要解決FCM檢測的標準化和檢驗技師的培訓問題；質譜技術中復雜的樣品前處理、怎樣控制檢測變異、不同檢測平臺的數據整合等問題。但隨著高通量測序技術、數字PCR技術、芯片技術和蛋白質組學等新技術的發展，越來越多MRD標志物會被發現，將推動AL預后評估進入“MRD時代”。

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