成纖維細胞生長因子21對胰島素抵抗肝細胞葡萄糖攝取的影響及機制

白潔，王金鑫，宋紫暄，吳志敏，高雁，朱澤，李光明(天津醫科大學，天津00070；武警廣西總隊醫院；天津市美聯博科技有限公司)

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成纖維細胞生長因子21對胰島素抵抗肝細胞葡萄糖攝取的影響及機制

白潔1，王金鑫1，宋紫暄1，吳志敏2，高雁3，朱澤1，李光明1
(1天津醫科大學，天津300070；2武警廣西總隊醫院；3天津市美聯博科技有限公司)

目的 觀察體外合成成纖維細胞生長因子21(FGF21)對胰島素抵抗(IR)肝細胞葡萄糖攝取的影響，并探討其機制。方法 體外合成具有一定穩定性的熒光標記的FGF21 mRNA。將肝細胞置于含34.4 μg/mL重組胰島素和1 μg/mL地塞米松及10% FBS的RPMI-1640培養基中培養72 h，誘導建立IR肝細胞模型，將其分為模型對照組，胰島素組和FGF21組。模型對照組不添加任何藥物，胰島素組加入1 μg/mL重組胰島素，FGF21組電轉入FGF21 mRNA。采用葡萄糖氧化酶法測定3組細胞培養液中的葡萄糖含量，計算葡萄糖吸收量；實時熒光定量PCR方法檢測3組葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1) mRNA表達，Western blotting法檢測3組GLUT1蛋白表達。結果 與模型對照組相比，FGF21組葡萄糖吸收量升高，細胞GLUT1 mRNA及蛋白表達升高(P均<0.05)。與模型對照組相比，胰島素組葡萄糖吸收量不明顯，細胞GLUT1 mRNA及蛋白表達無明顯差異(P均>0.05)。結論 體外合成的FGF21 mRNA可以改善IR肝細胞對葡萄糖的攝取，其機制與增加GLUT1表達有關。

成纖維細胞生長因子21；葡萄糖轉運蛋白1；體外轉錄mRNA;葡萄糖攝取；胰島素抵抗；肝細胞

胰島素抵抗(IR)是胰島素的外周靶組織對內源性或外源性胰島素的敏感性和反應性降低，導致生理劑量的胰島素產生低于正常的生理效應。IR是多種代謝性疾病包括高血壓、血脂異常、冠心病、腦血管疾病伴2型糖尿病(T2DM)等發生的危險因素。成纖維細胞生長因子21(FGF21)是FGF家族成員，主要在肝臟中表達，以內分泌方式在體內發揮作用[1]。FGF21具有調節動物體內葡萄糖代謝平衡的作用。Berglund等[2]報道，FGF21可以緩解肥胖糖尿病模型小鼠的IR，持續調節體內糖脂代謝，刺激機體糖吸收，且不依賴胰島素的參與，可用于IR相關的T2DM治療。體外轉錄mRNA是新型的基因分子藥物類型，對比質粒DNA與病毒載體，無基因插入突變的風險，無免疫原性問題。葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)是機體分布最廣的葡萄糖轉運體，是人體轉運葡萄糖的主要載體，與代謝緊密相關，主要功能是調節葡萄糖攝取[3]。2016年5～10月，我們對IR細胞模型電轉入體外合成的FGF21 mRNA，觀察其能否改善IR細胞模型的葡萄糖攝取，為其用于T2DM的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 質粒PT7TS-FGF21、T7-GFP由本實驗室構建保存。正常人肝細胞L02由天津醫科大學解剖學實驗室惠贈。RPMI-1640培養基購自Hyclone公司，FBS購自Invitrogen公司，T7 RNA快速高效合成試劑盒購自Ambion公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、FastQuant RT Kit和SYBR Green PCR Master Mix購自天根生化科技有限公司，葡萄糖檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司，重組人胰島素、地塞米松、BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL發光液購自北京索萊寶公司。兔抗人、山羊抗兔IgG二抗和β-actin購自Abcam公司，限制性內切酶SpeⅠ、SalⅠ和EcoRⅤ購自TransGen Biotech公司。引物合成于GENEWIZ公司。

1.2 IR模型細胞的建立 參照文獻[4, 5]方法。取對數生長期肝細胞接種于96孔板，加入含20% FBS的RPMI-1640培養基，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h至細胞貼壁。將細胞加入含34.4 μg/mL重組胰島素和1 μg/mL地塞米松及10% FBS 的RPMI-1640培養基中培養72 h，誘導建立IR肝細胞模型。

1.3 FGF21 mRNA的體外合成 構建質粒PT7TS-FGF21-GFP，從T7-GFP質粒中擴增GFP基因，其上游引物為5′-CTGTCGAC (SalⅠ) ACTCACTATAGGGCC-3′、下游引物為5′-CGGATATC (EcoRⅤ) CTTTACTTGTACAGCTC-3′。 PCR反應條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，36 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環30次;72 ℃ 10 min。連接PT7TS-FGF21載體雙酶切載體片段與GFP回收片段，轉化后擴增重組質粒;經雙酶切鑒定后，按照T7 RNA快速高效合成試劑盒進行體外轉錄。

1.4 IR肝細胞的分組與處理 將IR肝細胞分為模型對照組、胰島素組和FGF21組。模型對照組不給予任何藥物，胰島素組加入1 μg/mL重組胰島素，FGF21組電轉入FGF21 mRNA。FGF21 mRNA向IR肝細胞轉染的方法：取IR肝細胞加入胰酶消化，加入5 mL PBS制成單細胞懸液，室溫離心，去上清，加入1 mL OPTI-MEM重懸細胞為2.5×107/mL。加入30 μg待轉染FGF21 mRNA至重懸細胞液，轉移細胞液至相應規格的電轉杯，電轉細胞分為3組，電轉參數分別為500 V 500 μs、400 V 500 μs、300 V 500 μs。電擊后，電轉杯置于恒溫培養箱中5～10 min，將細胞懸液轉移至預熱的培養基中培養24 h。待細胞貼壁后，熒光倒置顯微鏡下觀察GFP的表達(即轉染效率)，結果顯示電轉參數為500 V 500 μs條件下細胞的轉染率為85%，細胞存活率為75%，顯著高于400 V 500 μs與300 V 500 μs兩組。因此選取500 V 500 μs進行電轉。3組均在20%FBS RPMI-1640培養基37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h。

1.5 肝細胞葡萄糖吸收量檢測 取3組細胞培養液，采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法(GOD-POD)檢測培養基中的葡萄糖含量。樣本孔內加入10 μL樣本和1 000 μL工作液，校準孔內加入10 μL校準液和1 000 μL工作液，空白孔內加入10 μL蒸餾水和1 000 μL工作液。將各孔混合液混勻后，置于37 ℃水浴鍋反應10 min。酶標儀于波長505 nm處測定吸光度，利用空白孔調零。葡萄糖含量(mmol/L)=樣本吸光度(A)/校準吸光度(A)×校準液濃度。以未接種細胞的20%FBS RPMI-1640培養基中的葡萄糖含量做對照，計算各組葡萄糖吸收量。葡萄糖吸收量=(20%FBS RPMI-1640培養基葡萄糖標準含量-樣本培養液葡萄糖含量)/20%FBS RPMI-1640培養基葡萄糖標準含量×100%。

1.6 肝細胞GLUT1 mRNA表達檢測 用TRIzol試劑盒提取3組細胞總RNA，反轉錄合成cDNA。采用實時熒光定量反應檢測細胞GLUT1 mRNA，以β-actin作為內參，按照SYBR Green PCR Master Mix試劑說明書操作。GLUT1上游引物5′-CGTGCTTATGGGTTTCTCCAAA-3′，下游引物5′-GACACCTCCCCCACATACATG-3′，擴增片段123 bp。β-actin上游引物5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′，下游引物5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′，擴增片段500 bp。反應條件：94 ℃ 1 min，94℃ 30 s，64 ℃ 30 s，共30次循環。讀取Ct值，采用2-ΔΔCt法計算GLUT1 mRNA的相對表達量。

1.7 肝細胞GLUT1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集3組細胞提取總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量。蛋白樣品經上樣，SDS-PAGE電泳分離，300 mA 2 h電轉PVDF膜上。5%脫脂牛奶TBST中室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)兔抗人GLUT1，4 ℃放置過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗山羊抗兔IgG(1∶3 000)，室溫孵育1 h。HRP-ECL發光法，曝光，浸入顯影液中1～2 min，清水漂洗后用Bio-Rad圖像分析系統掃描條帶，用Image J分析條帶灰度。

2 結果

2.1 3組葡萄糖吸收量比較 模型對照組葡萄糖吸收量為0.38±0.07，胰島素組為0.39±0.03，FGF21組為0.47±0.06。胰島素組葡萄糖吸收量與模型對照組比較無統計學差異(P>0.05)，FGF21組較模型對照組升高(P<0.05)。

2.2 3組GLUT1 mRNA表達比較 模型對照組、胰島素組、FGF21組GLUT1 mRNA的相對表達量分別為1、1.36±0.37、3.88±0.60。胰島素組GLUT1 mRNA表達量與模型對照組比較無統計學差異(P>0.05),FGF21組較模型對照組升高(P<0.05)。

2.3 3組GLUT1蛋白表達比較 模型對照組、胰島素組、FGF21組GLUT1蛋白表達量分別為0.44±0.01、0.55±0.01、0.75±0.01。胰島素組GLUT1蛋白表達量與模型對照組比較無統計學差異(P>0.05)，FGF21組較模型對照組升高(P<0.05)。

3 討論

T2DM作為一種多基因遺傳性疾病，是環境因素和遺傳因素共同作用的結果，其基本特征為胰島β細胞功能缺陷和IR[6]。IR不僅是T2DM的發病機制之一，更貫穿于T2DM的發生、發展全過程。IR主要涉及到胰島素的三個重要靶器官，即肝、骨骼肌和脂肪組織[7]。肝臟是胰島素作用敏感位點，維持血糖穩定的重要器官。鑒于人正常肝細胞L02保留了人類肝細胞基本生物特性[8]，因此本研究選取L02來建立細胞模型，模擬了T2DM情況下細胞糖代謝狀態，同時觀察干預因素對模型細胞IR狀態下的糖代謝的影響，篩選提高胰島素敏感性的藥物。有研究表明[9]，腫瘤本身也存在IR，與肝腫瘤細胞相比，本研究中采用L02正常肝細胞建立IR肝細胞模型，能夠減少干擾因素，獲得更可靠的實驗結果；且與動物模型相比，具有價格低、周期短、重復性強等優點。

FGF21與機體糖脂代謝的調節密切相關。實驗[10, 11]證明，FGF21敲除小鼠體內糖異生減少，出現高血糖，小鼠體質量輕度增加，葡萄糖耐量降低；而FGF21過表達小鼠體質量減輕，葡萄糖耐量增加。近年來，FGF21作為糖尿病的治療靶標，其降低糖尿病小鼠血糖、降低胰島素使用濃度、顯著改善糖尿病小鼠的肝臟胰島素敏感度等相關特性逐漸為研究人員所關注。本研究的創新之處在于利用電轉的方式使mRNA進入細胞來發揮其作用。電穿孔技術是目前體外轉錄mRNA進入細胞的普遍方法，與質粒DNA轉染相比，mRNA電轉對電子設置要求相對較低，對細胞的毒性較小。Van Tendeloo等[12]研究表明，mRNA電轉細胞的存活率較高。本研究觀察了不同條件下FGF21 mRNA的電轉效率。結果顯示，電轉條件300、400、500 V時轉染率均超過50%，其中500 V時細胞具有較高的存活率，以此作為優化實驗選取的最佳條件。鑒于引起機體產生IR的因素包括高濃度胰島素、糖皮質激素、游離脂肪酸及炎癥因子等[13]，本研究模擬體內高濃度胰島素狀態，同時配合糖皮質激素的誘導作用，建立IR體外細胞模型，選用34.4 μg/mL重組胰島素和1 μg/mL地塞米松。本實驗采用GOD-POD檢測細胞對葡萄糖的攝取量，對比經典的需要放射性同位素3H或14C標記參與的葡萄糖攝取實驗，污染小、經濟，不需要特殊儀器，且細胞可以用于后續的實驗[14]。為了研究FGF21促進IR模型肝細胞的葡萄糖攝取機制，我們檢測了IR模型肝細胞L02中的GLUT1 mRNA和蛋白表達，結果顯示FGF21 mRNA使模型細胞的GLUT1 mRNA和蛋白表達量顯著提高，而GLUT1作為體內分布最多的葡萄糖轉運載體，協助葡萄糖通過細胞膜。因此認為，FGF21 mRNA提高IR模型肝細胞葡萄糖攝取的作用可能與其增加GLUT1表達有關。

綜上所述，我們首次將FGF21 mRNA電轉入IR肝細胞模型，發現可以改善IR狀態下肝細胞對于葡萄糖的攝取，說明FGF21對于血糖的維持有重要作用。這為T2DM患者帶來了新的希望，將成為治療T2DM的新型靶向基因分子藥物類型。

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Effect of FGF-21 on glucose uptake of insulin-resistant liver cells

BAIJie1,WANGJinxin,SONGZixuan,WUZhimin,GAOYan,ZHUZe,LIGuangming

(1TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Objective To observe the effect of fibroblast growth factors-21 (FGF21) on glucose uptake of insulin-resistant (IR) liver cells. Methods The fluorescently labeled FGF21 mRNA with certain stability was synthesized in vitro. The liver cells were cultured for 72 h in RPMI-1640 medium supplemented with 34.4 μmol/L recombinant insulin and 1 μmol/L dexamethasone to establish IR cell models, and then IR cell models were divided into the model control group, insulin group, and FGF21 group. We did not add any drugs into the model control group. The insulin group was treated with 1 μmol/L recombinant insulin and FGF21 group was transfected with FGF21 mRNA. The cell glucose uptake in the three groups was measured by glucose oxidase (GOD-POD) assay. The mRNA and protein expression of glucose transporter 1 (GLUT1) was detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting. Results Compared with the model control group, the glucose uptake of the FGF21 group increased and the expression of GLUT1 mRNA and protein increased (allP<0.05).Compared with the model control group, the glucose uptake of the FGF21 group did not change significantly in the insulin group, and no significant difference was found in the GLUT1 mRNA and protein expression as compared with that of the model control group (allP>0.05). Conclusion FGF21 mRNA synthesized in vitro can improve the glucose uptake of IR liver cells, and its mechanism is related to the increase of GLUT1 expression.

fibroblast growth factors-21; glucose transporter 1; in vitro transcription of RNA; glucose uptake; insulin resistance; hepatic cells

天津市科技計劃項目(14ZCZDCX00054)。

白潔(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向為基因轉錄的機制及疾病的生物治療。E-mail: baijiexyz@163.com

李光明(1978-)，男，講師，主要研究方向為mRNA的合成與表達。E-mail: li-guangming@hotmail.com

朱澤(1967-)，男，教授，主要研究方向為基因的轉錄機制及疾病的生物治療。E-mail: zhuze@tijmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.002

Q81

A

1002-266X(2017)26-0005-04

2016-12-27)