Panx1基因過表達對人肝癌Hep3B細胞增殖及遷移的影響

劉傳亮，譚雪瑩，史光軍

(青島大學醫學院附屬青島市市立醫院，山東青島266000)

Panx1基因過表達對人肝癌Hep3B細胞增殖及遷移的影響

劉傳亮，譚雪瑩，史光軍

(青島大學醫學院附屬青島市市立醫院，山東青島266000)

目的探討Panx1基因過表達對人肝癌Hep3B細胞增殖及遷移的影響。方法構建Panx1過表達慢病毒質粒和過表達空載慢病毒質粒，包裝生產慢病毒，分別轉染Hep3B細胞(過表達組、對照組)。用Western blotting法檢測Hep3B細胞Panx1、上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)表達，CCK-8法檢測細胞增殖能力(OD值)，劃痕實驗檢測細胞遷移能力(相對遷移距離、劃痕愈合率)。結果過表達組Panx1、E-cadherin蛋白相對表達量較對照組高(P均<0.05)，Vimentin蛋白相對表達量較對照組低(P<0.05)；各時間點(0 h除外)OD值較對照組低(P均<0.05);相對遷移距離較對照組低,劃痕愈合率較對照組高(P均<0.05)。結論Panx1基因過表達可抑制Hep3B細胞增殖與遷移。

肝腫瘤；Panx1基因；Hep3B細胞；細胞增殖；細胞遷移

肝癌是癌癥死亡的第三大原因，僅次于肺癌和胃癌[1,2]。該病起病隱匿，多數患者確診時已發生轉移，患者總體生存率低[3,4]。探討與腫瘤轉移相關的因素，尋找新的防治靶點，是臨床面臨的重要任務。Pannexin基因是近年發現的縫隙連接家族的新成員，主要有Panx1、Panx2、Panx3三種亞型[5]。Panx1的6個亞基形成1個六聚體，其主要功能是形成大孔單膜通道，該通道可由電壓、細胞內高鈣、細胞外高鉀等刺激激活。Panx1通道在細胞通訊和信號傳遞過程中發揮調控作用[6,7]。研究表明，Panx1參與細胞增殖、細胞分化、炎癥發生、腦缺血、癲癇和腫瘤等的發生發展[8～10]。2017年1～7月, 本研究構建Panx1過表達慢病毒質粒，用其轉染人肝癌Hep3B細胞，觀察Hep3B細胞增殖、遷移能力的變化，以探討Panx1在肝癌細胞中的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑來源 人肝癌細胞株Hep3B、人胚腎細胞293T購自中國科學院上海細胞庫；Opti-MEM、DMEM培養基、胎牛血清、胰酶、PBS購自Gibico公司；CCK-8購自日本DoJINDO公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液購自中國碧云天生物技術研究所；青鏈雙抗購自美國Hyclone公司；Panx1抗體、GAPDH抗體，HRP二抗購自Sigma公司；Panx1過表達質粒和過表達空載質粒、購自南通思特康生物科技有限公司；質粒DNA中抽試劑盒購自Invitrogen公司；慢病毒pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G包裝質粒來源于本實驗室。

1.2 慢病毒包裝及Hep3B穩轉株構建 病毒包裝系統為三質粒系統，由pCMV-dR8.91、pCMV-VSVG、Panx1-OE/Panx1-OE-control組成。293T細胞融合度在80%～90%時，將三種質粒聯合PEI轉染至293T細胞，轉染5 h后更換完全培養基，24 h后換液，48 h后收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，72 h后再次收集，5 000 r/min離心15 min，去除細胞碎片，離心后以0.45 μm濾器過濾，過濾后檢測病毒滴度，分裝于15 mL離心管中，置于-80 ℃冰箱保存。通過梯度實驗來確定嘌呤霉素對Hep3B細胞的最佳致死藥物濃度，將Hep3B細胞隨機分為過表達組與對照組，分別轉染Panx1-OE慢病毒和Panx1-OE-control，加入感染增強劑polybrene(終濃度5 μg/mL)，24 h后換液，48 h后加嘌呤霉素2 μL篩選(濃度10 mg/mL)，隔1 d換1次篩選培養基，篩選1周。慢病毒攜帶的Panx1基因即可獲得穩定表達。

1.3 Hep3B細胞Panx1、上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)表達檢測 采用Western blotting法。Hep3B穩轉細胞消化裂解，提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白總濃度，根據Panx1蛋白相對分子質量配制濃縮膠和分離膠，等膠凝固后，將其放入電泳槽中，加電泳液，取各組蛋白30 μg上樣到10%膠，電泳結束后，使用轉膜裝置，100 V恒壓條件下電轉90 min，將蛋白轉移到NC膜，于TBST配5%的脫脂牛奶常溫下封閉1 h后，TBST洗膜3次，每次10 min，加入TBST稀釋的一抗(anti Panx1 1∶500；anti GAPDH 1∶2 000；anti E-cadherin 1∶1 000；anti Vimentin 1∶1 000)，4 ℃孵育12 h，孵育完TBST洗膜3次，加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。配制蛋白顯影液上機檢測。用Image Pro Plus 軟件分析光密度(OD)值。

1.4 Hep3B細胞增殖能力檢測 采用CCK-8實驗。取兩組細胞，分別制成1.5×104/mL的細胞懸液，接種于96孔板中，每組設6個復孔，每孔100 μL細胞懸液，鋪六塊板。繼續培養0、24、48、72、96、120 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL置于37 ℃、5% CO2的培養箱繼續培養2 h，用酶標儀測波長450 nm處OD值，每組去掉最大值和最小值，取平均值。

1.5 Hep3B細胞遷移能力檢測 采用劃痕實驗。在六孔板后面用記號筆每孔標記5條橫線，取兩組細胞鋪六孔板，第2天長滿，用20 μL槍頭剪平，每孔劃3條垂直于后面的橫線。PBS緩慢清洗3次，去除懸浮細胞，加入無血清培養基，顯微鏡下拍照，培養24 h后，再次拍照，記錄兩次拍照劃痕的距離。用Image Pro Plus 軟件處理分析。相對遷移距離=0 h劃痕面積/高度-24 h面積/高度，劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 Panx1基因過表達對Hep3B細胞Panx1、E-cadherin及Vimentin蛋白表達的影響 過表達組Panx1、E-cadherin及Vimentin蛋白相對表達量分別為1.28±0.17、0.83±0.22、0.08±0.01；對照組分別為0.56±0.13、0.26±0.04、0.48±0.16。兩組Panx1、E-cadherin及Vimentin蛋白相對表達量比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

2.2 Panx1基因過表達對Hep3B細胞增殖能力(OD值)的影響 培養0、24、48、72、96、120 h，過表達組OD值分別為0.201±0.003、0.235±0.006、0.282±0.005、0.359±0.012、0.479±0.005、0.601±0.013；對照組分別為0.199±0.002、0.249±0.002、0.337±0.007、0.479±0.009、0.678±0.004、0.890±0.006。兩組各時間點(0 h除外)OD值比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

2.3 Panx1基因過表達對Hep3B細胞遷移能力的影響 過表達組相對遷移距離為0.59±0.09，劃痕愈合率為15.01%±1.69%；對照組分別為0.98%±0.07%、27.11%±2.21%。兩組相對遷移距離、劃痕愈合率比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

3 討論

轉移是癌癥患者預后差的主要因素。Panx1已被證實在多種腫瘤增殖和轉移中發揮重要作用，在不同器官和組織，其發揮的功能不同，如Lai等[11]發現在Panx1缺陷型大鼠C6膠質瘤細胞中，過表達Panx1起到腫瘤抑制作用，但在人神經膠質瘤細胞系中內源表達則加速膠質瘤腫瘤聚集體形成。在轉移進展期間，循環的癌細胞會滯留在末端血管內，大部分死于機械變形，Furlow等[12]研究表明，在高度轉移性乳腺癌中，Panx1可通過增加膜通道的機械敏感性，使轉移性細胞存活，使用Panx1通道抑制劑顯著降低了乳腺癌轉移的效率。這些數據表明在微血管系統誘導的生物力學創傷中Panx1可促進乳腺癌細胞的轉移。Li等[13]發現沉默Panx1可抑制U87MG細胞的增殖。Schalper等[14]報道Panx1在膽囊腺癌和膽囊組織中表達不同，在膽囊腺癌中表達較低，使用Ki67和Panx1免疫染色，發現Panx1表達與膽囊癌增殖呈負相關。但Panx1對肝癌細胞增殖及遷移的作用目前尚未報道。本實驗前期研究發現Panx1在肝癌和肝正常組織表達有顯著差異，在肝癌中表達高于癌旁組織。提示Panx1可能發揮癌基因的作用。

為進一步探討Panx1與肝癌細胞增殖和轉移的關系，本研究構建了Panx1過表達慢病毒質粒和慢病毒空載質粒，慢病毒是以人類免疫缺陷1型病毒為缺陷發展的基因治療載體，能將外源基因有效的整合到宿主染色體上，從而達到持久穩定的表達，對感染細胞和非感染細胞均具有感染能力。慢病毒包裝由慢病毒表達載體和慢病毒包裝載體組成，本研究應用慢病毒原理，在脂質體介導下將慢病毒質粒轉染至293T細胞，收集病毒液感染Hep3B細胞，構建了Hep3B穩轉細胞株，能長久過表達Panx1基因。研究證實，EMT是腫瘤轉移的必要步驟，其過程涉及細胞表型的變化，E-cadherin和Vimentin是關鍵的標志物，Vimentin蛋白與腫瘤增殖和轉移呈正相關，E-cadherin蛋白與腫瘤生殖轉移呈負相關。Western blotting檢測蛋白(Panx1,E-cadherin,Vimentin)的表達，發現Hep3B細胞中三種蛋白表達具有顯著差異，相對于對照組，過表達組Panx1蛋白表達效率高，vimentin蛋白表達量顯著降低，E-cadherin蛋白表達顯著增高，差異均有統計學意義，提示Panx1可能有抑制細胞轉移的功能。

為求進一步驗證其在細胞遷移中的作用，進行劃痕實驗，劃痕結果顯示，與對照組相比，過表達組細胞遷移能力減弱，說明Panx1基因過表達后抑制了腫瘤的遷移。CCK-8結果表明，與對照組相比， Panx1過表達明顯抑制了Hep3B細胞的增殖活力。提示Panx1對人肝癌Hep3B細胞增殖和遷移均有抑制作用。

綜上，Panx1可能與肝癌細胞的增殖和遷移密切相關，其在肝癌的發生發展中可能起到抑制作用，Panx1有望成為肝癌的治療靶分子。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.33.011

R735.7

A

1002-266X(2017)33-0035-03

史光軍(E-mail:sgjzp@hotmail.com)

2017-07-07)