兔眼視網膜神經上皮層下內界膜移植轉歸觀察

吳鵬，高榮玉，徐鑫彥，張杰，任建濤，韓海濤，黃旭東

(濰坊眼科醫院 國家臨床重點專科建設項目單位，山東濰坊261041)

兔眼視網膜神經上皮層下內界膜移植轉歸觀察

吳鵬，高榮玉，徐鑫彥，張杰，任建濤，韓海濤，黃旭東

(濰坊眼科醫院 國家臨床重點專科建設項目單位，山東濰坊261041)

目的觀察兔眼視網膜神經上皮層下人眼內界膜移植的轉歸情況。方法選擇特發性黃斑裂孔患者6例，采用常規23G經睫狀體平坦部無縫合三通道玻璃體切割手術進行內界膜剝除，將剝除的內界膜置入5- (4,6- 二氯三嗪基)氨基熒光素中染色，磷酸鹽緩沖液漂洗后備用。選擇青紫藍兔6只，速眠新Ⅱ注射液麻醉后行23G無縫合常規三通道經睫狀體平坦部玻璃體切除術。切除晶狀體，保留晶狀體前囊膜，應用4 mg/0.1 mL曲安奈德染色玻璃體后將其切除,然后行人工視網膜脫離，脫離范圍約1 PD范圍，在脫離的視網膜邊緣部作一長約1.5 mm的條形裂孔，將染色好的人眼視網膜內界膜填塞入脫離的視網膜神經上皮層下方。分別于術后3、10、30天采集術眼眼底彩色圖像及光學相干斷層掃描(OCT)圖像，觀察移植物情況；采集圖像后，各時間點處死內界膜移植片在位兔1只，制備快速冰凍病理切片，使用共聚焦顯微鏡觀察神經上皮層下的內界膜變化。結果術后3天眼底彩色圖像及OCT圖像可見4只兔內界膜移植片在位、2只兔出現視網膜脫離導致內界膜移植片移位，激光共聚焦顯微鏡下可見黃綠色熒光條帶；術后10天，眼底彩色圖像可隱約觀察到內界膜移植成功的4只兔視網膜下淺黃色內界膜移植片，OCT圖像可觀察到移植的內界膜片段，激光共聚焦顯微鏡下可見黃綠色熒光條帶片段化。術后30天，眼底彩色圖像及OCT圖像中內界膜移植片均已不可辨認，黃綠色熒光條帶消失。結論移植入兔眼視網膜神經上皮層下的人眼視網膜內界膜最終被降解吸收，不會在視網膜下形成永久性瘢痕。

特發性黃斑裂孔；內界膜移植；視網膜神經上皮；兔

黃斑裂孔是指黃斑部視網膜內界膜至感光細胞層發生的組織缺損，是一種嚴重損害視功能的疾病。玻璃體切割聯合內界膜剝除術后惰性氣體填充是目前治療黃斑裂孔最主要的手段，可使黃斑裂孔閉合率達到90%以上。但對于特發性黃斑裂孔，如巨大黃斑裂孔、高度近視性黃斑裂孔、第一次手術后未閉合的黃斑裂孔等，如按常規方法治療，裂孔閉合率較低[1]。研究證實，內界膜移植可誘導神經膠質細胞橋樣增殖，促進黃斑裂孔閉合，并驅使光感受器細胞復位，繼而促進視功能恢復[2，3]。但內界膜是muller細胞的基底膜，主要成分是Ⅳ型膠原纖維，可在膠原酶的作用下降解，亦可形成瘢痕組織，故移植入裂孔內的內界膜轉歸情況存在爭議。為此，我們于2016年12月～2017年1月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 健康青紫藍兔6只，雌雄不限，3月齡，體質量(1.3±0.8) kg。Accrus玻切機，美國愛爾康公司；Resight非接觸式廣角系統，德國蔡司公司；Spectralis OCT，德國海德堡公司；直接眼底鏡，蘇州六六視覺科技股份有限公司。速眠新Ⅱ注射液，軍事醫學科學院軍事獸醫研究所；5- (4，6- 二氯三嗪基)氨基熒光素(5- DTAF)，美國AAT Bioquest公司；磷酸鹽緩沖液、硅油，美國博士倫公司；曲安奈德，昆明積大制藥股份有限公司；OCT膠，重慶醫科大學基礎醫學研究所；鹽酸羅哌卡因，瑞典阿斯利康制藥有限公司。

1.2 人眼視網膜內界膜獲取和制備 選擇經裂隙燈、光學相干斷層掃描(OCT)等檢查確診，需行玻璃體切割聯合內界膜剝除手術治療的特發性黃斑裂孔患者，排除重大全身性疾病(如嚴重心力衰竭)而不能承受眼部手術者，共納入患者6例。所有患者簽署手術協議書，由同一名具有豐富經驗的眼科醫師切除視網膜內界膜。患者經鹽酸羅哌卡因球后麻醉，在Resight非接觸式廣角系統下，完成常規23G經睫狀體平坦部無縫合三通道玻璃體切割手術。于中央玻璃體完全切除后玻璃體腔內注射4 mg/0.1 mL曲安奈德染色，剝除以黃斑裂孔中心為圓心約2 PD范圍內的內界膜。將剝除的內界膜置入預先用0.2 mol/L NaHCO3配置的0.5% DTAF溶液中染色1 min，磷酸鹽緩沖液漂洗后呈淺黃色[4]，說明人眼視網膜內界膜制備成功。

1.3 兔視網膜裂孔模型制作及人眼視網膜內界膜植入 手術操作由同一名眼科醫師完成。所有實驗兔適應性喂養7天，術前臀部肌肉注射速眠新Ⅱ注射液0.01 mg/kg麻醉。麻醉完全后，于Resight非接觸式廣角系統下完成晶狀體切除聯合常規23G經睫狀體平坦部無縫合三通道玻璃體切割手術。基本步驟：23G鞏膜穿刺刀作常規三通道鞏膜穿刺口，放置套管并進行玻璃體腔灌注；玻切頭切除晶狀體，保留晶狀體前囊膜；4 mg/0.1 mL曲安奈德染色玻璃體后將其切除；38G針頭在其下方后極部視網膜下注入灌注液，行人工視網膜脫離，脫離范圍為穿刺點周圍約1 PD；用視網膜剪刀在脫離的視網膜邊緣作一長約1.5 mm的條形裂孔，將人眼視網膜內界膜植入脫離的視網膜神經上皮層下方；行氣-液交換后在裂孔表面注射粘彈劑，視網膜復位后注入硅油。術畢球結膜下立即注射妥布霉素40 mg、地塞米松2.5 mg，術后1個月內典必殊眼膏涂結膜囊、4次/d，阿托品眼膏涂結膜囊、2次/d。

1.4 相關指標觀察 術后1個月內每2～3天，裂隙燈下檢查眼部情況并觀察眼內炎癥反應情況，直接眼底鏡觀察眼底情況。術后3、10、30天采集術眼眼底彩色圖像及OCT圖像，觀察移植物情況；采集圖像后，每個時間點空氣栓塞處死內界膜移植片在位實驗兔1只，取眼球術區視網膜和球壁組織，立即制備冰凍切片，切片厚度8 μm，切片經4 μg/mL PI溶液常溫避光孵育15 min，PBS沖洗3 min×5次，PBS- 甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察照相。5- DTAF標記的內界膜組織呈黃綠色熒光，PI標記的細胞核呈紅色熒光。

2 結果

術后1個月內，所有實驗兔眼內無炎癥反應發生，玻璃體腔內硅油安靜。術后3天直接眼底鏡觀察到4只實驗兔內界膜移植片在位、2只實驗兔出現視網膜脫離導致內界膜移植片移位，眼底彩色圖像及OCT圖像證實直接眼底鏡觀察結果。激光共聚焦顯微鏡下可見黃綠色熒光條帶。術后10天，4只內界膜移植成功實驗兔眼底彩色圖像可隱約觀察到視網膜下淺黃色內界膜移植片，OCT圖像可見移植的內界膜片段，激光共聚焦顯微鏡下可見黃綠色熒光條帶片段化。術后30天，4只內界膜移植成功實驗兔眼底彩色圖像及OCT圖像中內界膜移植片均已不可辨認，黃綠色熒光條帶消失。見插頁Ⅱ圖3～5。

3 討論

玻璃體切割手術聯合內界膜剝除后惰性氣體填充，可使黃斑裂孔閉合率達到90%以上。但對于第一次手術后未閉合的黃斑裂孔、直徑巨大的黃斑裂孔、高度近視性黃斑裂孔等特發性黃斑裂孔，常規手術裂孔閉合率較低。國內外學者采用多種方法來提高其閉合率，如Alpatov等[5]在玻切手術中使用機械性推壓黃斑裂孔周圍視網膜使黃斑裂孔縮小；Charles等[6]在手術中于黃斑顳側行全層視網膜切開，以達到松解的目的；Reis等[7]在黃斑裂孔邊緣外1 PD范圍作5條向心性切口，切口深度達到視網膜色素上皮細胞層，視網膜切開的目的是松解黃斑裂孔周圍組織的牽拉，促進黃斑裂孔閉合。但上述方法均未取得預期效果。

目前，內界膜移植治療特發性黃斑裂孔成為臨床研究的熱點[2，8]。其核心技術是將部分視網膜內界膜移到黃斑裂孔內，將黃斑裂孔區域暴露的視網膜色素上皮覆蓋。其促進黃斑裂孔閉合的機制：①黃斑裂孔內植入內界膜可恢復原來相對封閉的環境，通過Na+- K+- ATP酶將視網膜下液體轉運到裂孔外，使視網膜恢復貼附，從而促進裂孔閉合[9]；②巨噬樣細胞激活muller細胞誘導神經膠質細胞增生[10～12]，而內界膜內有muller細胞片段，移植的內界膜可促進視網膜內及內界膜移植片表面的膠質細胞增殖，利用內界膜作為支架，最終促進裂孔閉合。此外，Muller細胞承擔著傳遞光線從視網膜表層到光感受器細胞層的作用[13，14]。有文獻報道，對直徑大于400 μm的黃斑裂孔患者行內界膜移植術后，裂孔閉合率高于行內界膜剝除患者[15]。目前對內界膜移植入黃斑裂孔內的轉歸存在爭議。有研究認為，移植的內界膜很快降解，其不僅能促進黃斑裂孔閉合，還可促進視功能恢復；也有研究認為，內界膜移植后，黃斑裂孔區厚度較未行內界膜移植的黃斑裂孔區厚，說明內界膜移植后黃斑裂孔的閉合是瘢痕閉合，可阻礙視功能的恢復。

文獻報道，人眼黃斑區視網膜平均厚度為215 μm[16，17]，而兔眼視網膜平均厚度約為113 μm[18，19]，相對較薄，其內界膜難以剝除。本研究曾嘗試剝除兔眼視網膜內界膜，但未能成功，故選用人眼視網膜內界膜代替。本研究結果顯示，術后3、10天均發現兔眼視網膜神經上皮層下被染色的內界膜移植片，隨時間延長，其呈現片段化，呈現逐漸降解狀態；而術后30天時未發現黃綠色熒光，證明內界膜作為Ⅳ型膠原纖維最終被降解。本研究間接證實了填塞入黃斑裂孔的內界膜可作為支架，促進膠質細胞增殖，待黃斑裂孔閉合后最終被降解。文獻報道，黃斑裂孔的閉合時間一般為3天[20，21]；對于裂孔較小、易于閉合的黃斑裂孔，內界膜移植并不能加速閉合，反而可能將其作為異物，阻礙視細胞向裂孔中心復位，不利于黃斑裂孔閉合及視功能的恢復，但對于巨大的特發性黃斑裂孔是有助于裂孔閉合的，這為內界膜移植的適應證提供了依據。此外，移植過程中應將內界膜盡量修理至與裂孔直徑相當，這樣可加速黃斑裂孔閉合過程中內界膜的降解速度。

總之，我們認為兔眼視網膜神經上皮層下植入的人眼內界膜可作為膠質細胞增殖的臨時支架，最終會被降解吸收，不會在視網膜下形成永久性瘢痕。

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山東省自然科學基金資助項目(ZR2013HM108)。

黃旭東(E- mail： hxd3333@163.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.009

R774.5

A

1002- 266X(2017)36- 0031- 03

2017- 08- 05)

文后參考文獻的著錄方法

按GB/T7714- 2005《文后參考文獻著錄規劃》采用順序編碼制著錄，依照其在文中出現的先后順序用阿拉伯數字加方括號標出。參考文獻中的作者1～3名全部列出，3名以上只列前3名，后加“，等”或其他與之相應的文字。外文期刊名稱用縮寫，以《Index Medicus》中的格式為準；中文期刊用全名。論文題目后加文獻類型及標識，如專著[M]、期刊文章[J]等。每條參考文獻均須著錄起止頁。作者必須認真核對參考文獻原文，無誤后將其按引用順序(用阿拉伯數字)排列于文末。