RyR2磷酸化在心力衰竭中的作用

陳會花(綜述) 章 忱 呂 嶸(審校)

(上海中醫藥大學病理教研室 上海 201203)

RyR2磷酸化在心力衰竭中的作用

陳會花(綜述) 章 忱 呂 嶸△(審校)

(上海中醫藥大學病理教研室 上海 201203)

心力衰竭在細胞水平主要表現為心肌以興奮-收縮耦聯(excitement-contraction coupling,ECC)為基礎的收縮功能障礙,而Ca2+信號轉導在此過程中起著非常重要的作用。肌漿網(sarcoplasmic reticulum,SR)蘭尼堿受體(ryanodine receptor type 2,RyR2)是心肌最重要的鈣釋放通道,RyR2磷酸化是肌漿網鈣釋放的基礎,而RyR2磷酸化主要受蛋白激酶A (protein kinase A ,PKA)和鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ (calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)的調控。目前對RyR2磷酸化的研究已經非常廣泛,但對其涉及心力衰竭的具體發病機制仍有爭議,本綜述主要針此問題進行闡述。

蘭尼堿受體; 心力衰竭; 蛋白激酶A; 鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ

目前,心衰是引起死亡率和發病率升高的一個主要原因,嚴重威脅人類的生命健康。據最新研究[1]報道,全球每年約有1 750萬人死于心血管疾病,占全球死亡人數的31.25%,有研究[2]預測至2030年,死亡人數可能增至2 330萬,國外流行病學資料[3]顯示,心衰患者5年存活率為50%,40%的患者1年內會因心衰再次入院,有臨床癥狀的患者5 年存活率更與腫瘤患者相似。

蘭尼堿受體(RyR2)在興奮收縮耦聯中的作用 細胞膜去極化導致L-型鈣通道(L-type Ca2+channels,LTCCs)開放,胞外Ca2+內流,激活位于SR上的(ryanodine receptor type 2,RyR2),使SR中的Ca2+大量釋放進胞質,這個過程就是“鈣誘導的鈣釋放”(Ca2+-induced Ca2+release,CICR)[4]。位于橫管的LTCCs和位于肌漿網的RyR2極為貼近,這種高度精準的結構是引起“鈣瞬變”的基礎。胞質Ca2+濃度的升高可激活肌球蛋白頭部的Ca2+-Mg2+-ATP酶,水解ATP釋放能量,引發心肌收縮,完成由化學能向機械能的轉化,形成一次興奮-收縮耦聯[5]。心肌收縮后胞質內游離的Ca2+經SR上的鈣泵肌質網鈣ATP酶(sarco /endoplasic Ca2+-ATPase,SERCA)泵回SR 中儲存,另外多余的Ca2 +經鈉鈣交換體(Na+/Ca2+-exchanger,NCX1)泵出胞外[6]。

心衰過程中,心臟需要經歷代償性的改變,這種改變最終抑制胞內的鈣循環,并且降低SR內的鈣容量。因此,鈣誘導釋放的Ca2+就會減少,最終導致興奮-收縮耦聯時產生的收縮力降低[7]。RyR2是興奮-收縮耦聯過程中主要的Ca2 +釋放通道,SR經RyR2釋放Ca2+的量決定了鈣瞬變的幅度,而鈣瞬變的幅度與心肌收縮的力度相關[5]。

RyR2結構及其磷酸化 RyR2屬于RyR家族,是目前已知相對分子質量最大的離子通道,根據RyR最初純化的時間和組織來源不同,RyR受體共有3種亞型:RyR1、RyR2和RyR3,而RyR2主要分布于哺乳動物心肌細胞中[8]。最近Zalk等[9]成功解析了RyR的結構,RyR2是一種同源四聚體,四個原聚體圍繞成一個中央橫跨膜的孔隙,這個孔隙與四聚體的四重對稱軸一致。每個結構是以重復延伸的α-螺線管結構(α-solenoid)為基礎的,α-solenoid由5部分組成:3個SPRY區域(SPRY1,SPRY2和 SPRY3)和2對重復序列的RYR(RY12和 RY34),許多輔助蛋白都結合在α-solenoid上,包括FKBP12.6、鈣調蛋白、肌集鈣蛋白-2、連接素、三合蛋白、親連蛋白-2。另外原聚體還含有嵌入的EF-hands,它是以前假設的Ca2+結合域的主要組成,是鈣離子激活構象的開關,因此與Ca2+結合的EF-hands可以調節形成孔隙的跨膜螺旋管的構象,這樣每次離子大振幅的集體運動就可以增加通道打開的概率。這個機制也很好的解釋了Ca2+的結合是如何增加通道打開的機率卻不改變打開的周期,同時也可以解釋RyR胞質區結合的調節蛋白是如何起門控作用[9-11]。

RyR2有多個磷酸化位點,每一個位點磷酸化的穩態程度受多重蛋白激酶和磷酸酶的動態平衡影響,這可以精確的調控RyR2的磷酸化,最終調控通道活性。雖然絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶也有可能磷酸化RyR2,但大多數的研究主要在PKA和CaMKⅡ介導RyR2磷酸化方面[12-13]。

絲氨酸-2808(serine-2808,S2808,一些物種是S2809)是第一個被認證為RyR2殘基的磷酸化位點,并且被認為是PKA磷酸化RyR2的主要靶點。Marx等[13-14]和Wehrens等[15]在二維的脂質雙分子層結構上實驗,發現增加PKA純度可以增加單個RyR2通道打開的概率;若將S-2808突變為丙氨酸后,RyR2則不能被PKA磷酸化,RyR2通道打開的概率不會增加[16]。

絲氨酸-2814 (S2814,一些物種是S2815) 是第2個被認證為RyR2殘基的磷酸化位點,它是CaMK II磷酸化RyR2的主要靶點[16]。雖然對CaMK II磷酸化RyR2的作用靶點仍有爭議,但目前存在的一個共識是CaMKII介導RyR2磷酸化可以增加RyR2通道打開的概率。有研究[9]報道,不論在磷脂雙分子層的單通道水平還是在心室肌細胞水平上,都顯示CaMK II促進鈣火花頻率增加。Wehrens等[15-16]和Respress等[17]將S2814突變后,可以抑制CaMK II對RyR2的主要作用,這提示S2814是CaMKII磷酸化RyR2的主要靶點,但不是唯一靶點。

幾年前,絲氨酸-2030 (S2030,有些物種是S2031)曾被認為是RyR2磷酸化第3個靶點。Xiao等[18]實驗發現,PKA磷酸化RyR2 S2030位點可以增加肌質網對Ca2+的敏感性。但Wehrens等[15]和Huke等[19]都沒有證明這個磷酸化位點,因此S2030的生理功能還有待進一步研究。

心衰過程中RyR2磷酸化的改變 RyR2磷酸化在心衰中起重要作用,在心衰患者和動物模型中,我們都可以觀察到RyR2硫酸化增加導致的SR鈣滲漏增加[20-21]。然而,RyR2磷酸化在心衰中的病理機制存在很大的爭論。

PKA介導RyR2的過度磷酸化 最早證明心衰患者RyR2磷酸化發生改變的文章是由Marx等[14]在2000年發表。Marx等[14]Wehrens等[15]和Shan等[22]提出一個假設:心衰時交感神經興奮,激活PKA介導的RyR2 S2808過度磷酸化,同時抑制FKBP12.6與RyR2結合,增加RyR2打開的概率。

但此假設目前存在很大爭議。最大的爭議就是RyR2 S2808過度磷酸化是否在心衰過程中起決定性作用。Wehrens等[15]認為RyR2 S2808磷酸化在實驗性心肌缺血誘導的心衰進程中起關鍵作用。他們用RyR2 S2808敲除小鼠和野生型小鼠同時進行心肌缺血造模,造模4周后進行心功能檢測,結果顯示RyR2 S2808敲除小鼠較野生型小鼠在射血分數、收縮分數、每搏輸出量、左室內壓最大上升速率以及左室內壓最大下降速率等心功能方面明顯改善。同時,他們還發現RyR2 S2808敲除小鼠的RyR2不能被PKA磷酸化,并且PKA失去對FKBP12.6的調節,導致FKBP12.6不能與RyR2解離。然而,Zhang等[23]和Houser等[24]卻認為PKA介導的RyR2 S2808過度磷酸化并不能改變心肌收縮性,也不能改善心衰和心律失常的癥狀。他們同樣用RyR2 S2808敲除小鼠和野生型小鼠同時進行心肌缺血造模,造模4周后進行心功能檢測,卻發現心功能沒有任何改善。他們認為目前對交感神經系統調控心肌收縮的分子機制研究已經非常透徹,并且經典的β-腎上腺素受體激活LTCCs和SERCa的PLN通路完全可以解釋。PKA介導的LTCCs- RyR2復合體磷酸化可以增加LTCCs打開的概率,導致Ca2+內流增加,這一過程與交感神經調控一致。由于LTCCs介導的CICR完全可以激活興奮-收縮耦聯,所以這些反應不會明顯改變釋放儲存鈣離子復合物的數量。然而,通過激活交感神經增加LTCC鈣內流,可以增加肌質網的鈣儲備,使肌質網鈣負荷逐漸增加。經LTCC流入的鈣離子主要用于肌質網的鈣釋放和鈣負荷,這是近幾十年被公認的。

結構是功能的基礎,同時功能也改變結構,最近對RyR2結構的解析越加明確,從結構上支持第一種觀點;Houser等實驗存在最大的一個問題是樣本數量少,所以結果存在假陽性和假陰性的可能比較大;對于關鍵的心功能檢測,Wehrens等[15]用M型超聲和壓力-容積電導導管技術同時進行檢測,而Houser等只用M型超聲檢測心功能。

CaMKⅡ介導的RyR2磷酸化 目前許多研究[25-28]認為CaMKⅡ通過氧化應激通路或者基因突變介導RyR S2814磷酸化,使RyR2通道在舒張期或興奮-收縮耦聯時激活釋放Ca2+。因為在心肌梗死、急性或慢性胸主動脈縮窄、缺血再灌注損傷以及異丙腎上腺素、血管緊張素II、醛固酮誘導等多種心衰模型中,CaMK II抑制劑在都可以起作用。Van Oort等[11]發現,CaMKⅡ介導RyR2磷酸化是心衰、心律失常發生的主要原因。但Wehrens等[16]發現,在非缺血的擴張性心肌病患者中,RyR2 S2815磷酸化水平升高,而在缺血性心肌病中,RyR2 S2815磷酸化水平則不會升高。同時他們用RyRS2814A (點突變)的小鼠再次進行驗證,發現當RyRS2814A小鼠用胸主動脈結扎誘導壓力超負荷的心力衰竭模型時,可以顯著降低肌質網的Ca2+滲漏,增加肌質網的Ca2+負荷,顯著改善EF、FS、+dP/dt等心功能指標;但是,如果RyRS2814A小鼠用心肌梗死誘導心衰模型時,則不會出現這種改變。這與他們在臨床觀察到的結果相一致。另外,他們用野生型小鼠行胸主動脈結扎術,發現造模后8～16周,RyR2 S2814A磷酸化水平顯著增加。

最新研究[29]表明,PKA和CaMKⅡ在調控RyR2磷酸化時是有交互作用的,PKA既可以通過Ca2+直接激活CaMKⅡ,又可以通過激活磷酸二酯酶從而抑制CaMKⅡ;而CaMKⅡ同樣也可以通過激活磷酸二酯酶從而抑制PKA的活性。

從大量文獻可以看出,RyR磷酸化在心衰過程中的關鍵作用是毋庸置疑的,但具體是通過哪條通路,激活哪個位點仍有很大的爭議。引起爭議的原因有很多,例如心衰模型類型、動物背景、實驗方法、試劑等等。由于調控RyR2的上游信號分子眾多,信號通路復雜,所以實驗條件稍有不同就會導致結果大相徑庭。但科技在不斷進步,最近Peng等[30]首次報道了RyR2處于關閉和開放兩種不同狀態的近原子分辨率冷凍電鏡三維結構,這無疑是分子結構領域的重大突破,這對研究RyR2在心衰時的結構改變以及作用機制都有巨大的幫助,同時也為心衰時對RyR2進行靶點治療提供了可能。

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The role of RyR2 phosphorylation in heart failure

CHEN Hui-hua, ZHANG Chen,LYU Rong△

(DepartmentofPathology,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Heart failure is mainly characterized by myocardial systolic dysfunction ,which is based on excitement-contraction coupling on the cellular level,and calcium (Ca2+)signaling plays a very important role in this process.The ryanodine receptor (RyR)/calcium release channel on the sarcoplasmic reticulum (SR) is the major Ca2+source of required for cardiac muscle excitation-contraction coupling.RyR2 phosphorylation is the basis of SR calcium release,and RyR2 phosphorylation is mainly controled by protein kinase A (PKA) and calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ (CaMK Ⅱ).Although widely research in this area,excessive activation of RyR2 phosphorylation involved in the pathogenesis of heart failure are still controversial,which is discussed in this review.

ryanodine receptor; heart failure; protein kinase A; calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ

國家自然科學基金(81373858)

R541.6

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.03.018

2016-07-28;編輯:王蔚)

△Corresponding author E-mail:lurong@shutcm.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81373858).