成纖維細胞生長因子21對內質網應激誘導心肌細胞凋亡的影響及其機制研究

梁平平， 仲琳，龔磊，王佳慧，楊軍

基礎與實驗研究

成纖維細胞生長因子21對內質網應激誘導心肌細胞凋亡的影響及其機制研究

梁平平， 仲琳，龔磊，王佳慧，楊軍

目的：探討成纖維細胞生長因子21（FGF21）在內質網應激（ERS）誘導心肌細胞凋亡中的保護作用及其作用機制。

成纖維細胞生長因子；內質網；肌細胞,心臟；凋亡

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:279.)

成纖維細胞生長因子21（FGF21）是FGFs家族的一名新成員，其主要作用是參與糖脂代謝的調節[1]。近年來發現FGF21也可以作為心血管系統重要的保護因子，在減少心肌梗死面積、減緩動脈粥樣硬化的進展、減少心肌缺血再灌注損傷中具有重要的作用[2-4]。內質網應激（ERS）是導致高血壓、心肌缺血、動脈粥樣硬化、心肌肥厚、心力衰竭等發生發展的重要病理生理機制之一[5-7]。但是FGF21能否抑制內質網應激炎癥反應，從而減少內質網應激誘導的心血管疾病發生發展尚少見報道。本研究通過衣霉素（TM）構建內質網應激模型，觀察FGF21在心肌細胞中過表達對內質網應激誘導心肌細胞凋亡的影響。

1 材料和方法

材料：H9c2細胞（上海中國科學院細胞庫）；胎牛血清（FBS）、DMEM（Dulbecco改良的Eagle培養基）高糖型細胞培養液（Gibco，美國）；FGF21抗體（abcam，美國）； PERK抗體、phosphor-PERK抗體；核糖體真核生物起始因子2α（eIF2α）抗體、phosphor-eIF2α抗體、轉錄激活因子4（ATF4）抗體、JNK抗體、phosphor-JNK抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3剪切體（c-caspase-3）抗體（Cell Signaling Technology，美國）；B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）抗體、Bcl-2的相關X蛋白（Bax）抗體（武漢博士德生物工程有限公司，中國）；葡萄糖調節蛋白78（GRP78）抗體、CCAAT/ 增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）抗體、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（Santa Cruz，美國）；逆轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；衣霉素、RNA提取試劑盒、總蛋白質提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；X-tremeGENE轉染試劑盒（Roche，美國）；CCK8試劑盒（Dojindo，日本）；Tunel細胞凋亡檢測試劑盒、（南京凱基生物科技發展有限公司）。

細胞培養與內質網模型的建立：H9c2細胞常規培養于含10%FBS的高糖型DMEM中，置于37℃5% CO2細胞培養箱中。將H9c2細胞以1×106/孔接種于6孔板中，衣霉素于二甲基亞砜（DMSO）中溶解，待細胞培養至80 %融合時加入衣霉素至終濃度10 μM 繼續培養24 h。

pcDNA4-FGF21質粒的構建：按照Trizol試劑盒說明書提取H9c2細胞總RNA。取RNA模板1 μg逆轉錄合cDNA。應用軟件Primer Designer 5 .0 設計引物。上游5’-CCGAATTCGCCGCCACCA TGGACTGGATGAAATCTAGAGTTGGGGCC-3’；下游5’-GGCTCGAGAGATGCATAGCTGGGGCTTCGGCCT TG-3’，在上、下游引物中分別引入EcoRI和XhoI酶切位點，以H9c2細胞cDNA為模板進行PCR擴增大鼠全長FGF21基因（627bp），條件為：95℃ 5 min，94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃10 min，共35個循環。后續PCR 產物純化、切膠回收、酶切均按照試劑盒說明書進行。在T4 DNA 連接酶的作用下，將FGF21目的片段與pcDNA4/To/ mychis相連。經轉化、涂板后，挑取單克隆菌落，測序。測序正確者擴大培養，提取質粒DNA 并測定濃度。

pcDNA4-FGF21質粒轉染與分組：按照轉染試劑說明書進行轉染，以轉染 pcDNA4空載體質粒為轉染陰性對照。轉染48 h后，加入衣霉素至終濃度為10 μΜ，繼續培養24 h。實驗分為4個組：對照組、衣霉素處理組、pcDNA4-FGF21+衣霉素組、pcDNA4 + 衣霉素組。

蛋白免疫印跡（Western blotting）檢測蛋白表達：提取各實驗組細胞的蛋白并測定蛋白濃度，取50 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，蛋白充分分離后，轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，封閉液室溫封閉1h，加入一抗4℃過夜，洗膜3次，每次10 min，加入相應二抗室溫孵育1 h，洗膜后加入電化學發光（ECL）液顯影，β-actin作為對照，利用ImageJ軟件計算條帶灰度比，利用統計軟件進行統計分析。

細胞計數試劑盒（ CCK8）檢測細胞活力[8]：H9c2細胞以7×103/孔的密度接種于96孔培養板中，培養至80 %融合時，按上述細胞分組處理細胞，在各實驗組中加入100 μl的無血清DMEM培養基以及10 μl的CCK8溶液，繼續培養4h，用酶聯免疫檢測儀在450 nm處檢測OD值，細胞存活率（%）=（實驗組OD 值－空白對照組OD 值）/（對照組OD 值－空白對照組OD 值）× 100%，每組設3孔，結果取均值，所得比值進行統計分析。

細胞凋亡水平檢測（Tunel）：H9c2細胞以1×105/孔的密度接種于細胞爬片上，培養至80 %融合時。按上述細胞分組處理細胞，4%的多聚甲醛室溫固定30 min后，0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）室溫通透10 min，加入TAD酶反應液，37℃避光反應60 min，漂洗3次后，加入SF標記液37℃避光反應30 min，1%的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核10 min，加入抗熒光淬滅劑，封片。在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，每個實驗組隨機選擇5個視野拍照，計算凋亡細胞的數目和比值。

統計學分析：使用spss19.0軟件包進行統計分析，計量數據以表示，多組均數間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pcDNA4-FGF21成功構建并轉染于心肌細胞：

pcDNA4/To/myc-his-FGF21真核質粒，經EcoR I、XhoI 雙酶切（圖 1A）和測序鑒定，并通過Western blot 檢測myc標簽蛋白和FGF21過表達蛋白，從而證實pcDNA4-FGF21質粒構建正確并成功表達于H9c2細胞（圖1B）。

圖1 FGF21質粒構建和在H9c2細胞中過表達

2.2 內質網應激誘導心肌細胞FGF21的表達（圖2）：

與對照組相比，衣霉素處理組、pcDNA4 + 衣霉素組和pcDNA4-FGF21 +衣霉素組FGF21的表達增加（P＜0.01）。與衣霉素處理組及pcDNA4 + 衣霉素組比較，pcDNA4-FGF21 +衣霉素組FGF21表達增加（P＜0.01）。

圖2 內質網應激誘導心肌細胞FGF21的表達

2.3 FGF21過表達抑制內質網應激中PERK 和JNK介導的凋亡信號通路

與對照組相比，PERK介導的凋亡相關通路p-PERK、 p-eIF2α、 ATF4、CHOP蛋白表達水平在衣霉素處理組和pcDNA4 + 衣霉素組顯著增加（P＜0.05～0.01）。而與衣霉素處理組和pcDNA4 + 衣霉素組相比，pcDNA4-FGF21 +衣霉素組p-PERK、p-eIF2α、ATF4和CHOP蛋白表達水平則明顯降低（P＜0.05～0.01）（圖3A）。

我們同樣檢測了JNK介導的凋亡通路主要蛋白表達，發現與對照組相比，在衣霉素和pcDNA4 +衣霉素組中促凋亡蛋白p-JNK、GRP78、c-caspase-3、Bax/ Bcl-2蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05～0.01）。而與衣霉素處理組和pcDNA4 + 衣霉素組相比，在pcDNA4-FGF21 +衣霉素組p-JNK、GRP78、c-caspase-3、Bax/ Bcl-2蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05～0.01）（圖3B）。

2.4 FGF21過表達減輕內質網應激誘導的心肌細胞損傷

Tunel 染色后，胞核萎縮、碎裂、不規則，呈綠色顆粒的細胞即為凋亡細胞。結果顯示，衣霉素處理組和pcDNA4 + 衣霉素組細胞凋亡率較對照組顯著增加（P＜0.01）,而pcDNA4-FGF21 +衣霉素組細胞凋亡率則低于衣霉素處理組和pcDNA4 + 衣霉素組（P＜0.01）（圖4A）。CCK8結果顯示：與對照組相比，細胞存活率在衣霉素組和pcDNA4 + 衣霉素組明顯降低（P＜0.05～0.01），與pcDNA4 + 衣霉素組和衣霉素處理組相比，pcDNA4-FGF21 +衣霉素組細胞存活率則升高（P＜0.05）（圖4 B）。

圖3 FGF21抑制心肌細胞PERK和JNK介導的凋亡通路主要相關蛋白的表達

3 討論

大量研究證明內質網應激炎癥反應貫穿于心肌細胞損傷的全過程[9]，內質網應激導致大量未折疊蛋白的積聚，啟動未折疊蛋白反應（URP），URP主要包括三個跨膜蛋白受體：PERK、活化轉錄因子6（ATF6）和肌醇需求激酶1（IRE1）。這三個受體的激活可以誘導多種炎癥因子的合成與釋放，啟動炎癥反應，引起細胞凋亡[10]，其中，PERK和IRE1-JNK介導的凋亡通路是內質網應激誘導細胞的特征性通路，然而FGF21在心血管系統的保護作用是否與減輕內質網應激有關及其作用機制尚不清楚。

本實驗通過有效劑量的衣霉素構建內質網應激模型[11]，發現內質網應激明顯誘導心肌細胞FGF21的表達，提示內質網應激誘導FGF21的表達可能是心肌細胞進行功能代償和自我保護的一個反應。為了進一步檢測FGF21對內質網應激誘導心肌細胞凋亡的影響，我們通過FGF21在H9c2細胞中過表達，發現FGF21可以明顯減少PERK介導促凋亡通路主要相關蛋白：p-PERK，p-eIF2α，ATF4和CHOP蛋白表達。研究證明PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路是UPR最重要的促凋亡信號通路，GRP78與PERK解離，激活eIF2α，從而促進 ATF4誘導多種基因編碼促凋亡蛋白。其中CHOP作為內質網應激執行凋亡的關鍵蛋白，被上游信號ATF4大量激活和釋放，從而誘導細胞走向凋亡[12]。因此FGF21通過抑制 PERK介導的促凋亡通路，從而減少內質網應激誘導的細胞凋亡。

此外，IRE1-JNK信號通路也是內質網應激中的重要促凋亡通路，在內質網應激時，JNK發生磷酸化，誘導Bax/Bcl-2蛋白的表達，從而促進細胞凋亡，另外JNK還可以促進線粒體中細胞色素C向胞漿釋放，激活caspase-3，誘導細胞凋亡[13]。在我們研究中，FGF21過表達明顯減少JNK磷酸化水平，其介導的促凋亡蛋白c-caspase 3、GRP78和Bax/Bcl-2的表達明顯降低，內質網應激炎癥反應得到明顯的改善，因此FGF21通過抑制內質網應激相關凋亡信號通路，減少心肌細胞凋亡。

圖4 FGF21過表達減少內質網應激誘導的心肌細胞凋亡

本實驗證實內源性FGF21在心肌細胞內質網應激中表達上調，提示內質網應激誘導FGF21的表達可能是心肌細胞抵抗內質網應激損傷的自身代償反應。我們進一步研究發現FGF21過表達明顯減少內質網應激誘導的心肌細胞凋亡，其機制可能部分與抑制內質網應激中PERK和JNK介導的凋亡通路信號傳導有關，但其更進一步的信號機制還需深入研究。

[1] 付坤, 劉景華. 成纖維細胞生長因子FGF21: 從生理作用到臨床研究. 中國循環雜志, 2014, 29: 309-311.

[2] Planavila A, Redondo-Angulo I, Villarroya F. FGF21 and cardiac physiopathology. Front Endocrinol (Lausanne), 2015, 6: 133.

[3] Liu SQ, Roberts D, Kharitonenkov A, et al. Endocrine protection of ischemic myocardium by FGF21 from the liver and adipose tissue. Sci Rep, 2013, 3: 2767.

[4] Chow WS, Xu A, Woo YC, et al. Serum fibroblast growth factor-21 levels are associated with carotid atherosclerosis independent of established cardiovascular risk factors. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2013, 33: 2454-2459.

[5] Sun Y, Zhang T, Li L, et al. Induction of apoptosis by hypertension via endoplasmic reticulum stress. Kidney Blood Press Res, 2015, 40: 41-51.

[6] Sozen E, Karademir B, Ozer NK. Basic mechanisms in endoplasmic reticulum stress and relation to cardiovascular diseases. Free Radic Biol Med, 2015, 78: 30-41.

[7] Liu J, Ren F, Cheng Q, et al. Endoplasmic reticulum stress modulates liver inflammatory immune response in the pathogenesis of liver ischemia and reperfusion injury. Transplantation, 2012, 94: 211-217.

[8] Zhao GL, Yu LM, Gao WL, et al. Berberine protects rat heart from ischemia/reperfusion injury via activating JAK2/STAT3 signaling and attenuating endoplasmic reticulum stress. Acta Pharmacol 2016, 37: 354-367.

[9] Zhang K, Kaufman RJ. From endoplasmic-reticulum stress to the inflammatory response. Nature, 2008, 454: 455-462.

[10] Guo X, Ren F, Zhang X, et al. Endoplasmic reticulum stress collaborates with lipopolysaccharide to promote the inflammatory response in macrophages. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 2015, 23: 604-608.

[11] Hwang HJ, Jung TW, Ryu JY, et al. Dipeptidyl petidase-IV inhibitor (gemigliptin) inhibits tunicamycin-induced endoplasmic reticulum stress, apoptosis and inflammation in H9c2 cardiomyocytes. Mol Cell Endocrinol, 2014, 392: 1-7.

[12] 顧晨, 李俊明. 內質網應激致2型糖尿病缺血心肌易損性增強的機制研究. 中國循環雜志, 2016, 31: 91-95.

[13] Zhang J, Xia Y, Xu Z, et al. Propofol Suppressed Hypoxia/ Reoxygenation-Induced Apoptosis in HBVSMC by Regulation of the Expression of Bcl-2, Bax, Caspase3, Kir6. 1, and p-JNK. Oxid Med Cell Longev, 2016, 2016: 1518738.

Effect of Fibroblast Growth Factor 21 on Endoplasmic Reticulum Stress Induced Rat’s H9c2 Cardiomyocyte Apoptosis With its Mechanism

LIANG Ping-ping, ZHONG Lin, GONG Lei, WANG Jia-hui, YANG Jun.
Department of Cardiology, Yantai Yuhuangding Hospital, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Yantai (264000), Shandong, China

YANG Jun, Email: yangjun19640124@163.com

Objective: To explore the protective roll of fibroblast growth factor 21 (FGF21) in endoplasmic reticulum stress (ERS) induced rat’s H9c2 cardiomyocyte apoptosis with its mechanism.Methods: pcDNA4 was used as gene vector, pcDNA4-FGF21 plasmid was constructed and transfected into rat’s H9c2 myocardiocytes for 48 h. ERS model was established by 10 μM tunicamycin (TM) induction for 24 h. The experiment was conducted in 4 groups:①Control group,②TM group, the cells were treated by TM,③pcDNA4-FGF21+TM group,④pcDNA4+TM group. The expressions of FGF21, protein kinase R-like ER kinase (PERK) and c-Jun N-terminal kinases (JNK) mediated apoptosis pathway related protein were measured by Western blot analysis; cell survival rate was examined by CCK-8 method and apoptosis rate was detected by TUNEL technique.Results: pcDNA4-FGF21 vector was successfully constructed and overexpressed in H9c2 myocardiocytes. Compared with Control group, TM group and pcDNA4+TM group had up-regulated endogenous FGF21 expression, increased PERK and JNK mediated apoptosis pathway related protein expression; reduced cell survival rate and elevated apoptosis rate. Compared with TM group and pcDNA4+TM group, pcDNA4-FGF21+TM group had down-regulated PERK and JNKmediated apoptosis pathway related protein expression; increased cell survival rate and decreased apoptosis rate.Conclusion: FGF21 overexpression can reduce ERS induced apoptosis rat’s H9c2 myocardiocytes which might be partly related for inhibiting PERK and JNK mediated signal transduction of apoptosis pathway.

Fibroblast growth factor; Endoplasmic reticulum; Myocyte, cardiac; Apoptosis

2016-04-28)

(編輯: 汪碧蓉)

264000 山東省煙臺市，青島大學醫學院附屬煙臺毓璜頂醫院 心內科（梁平平，仲琳，楊軍）,生物芯片（龔磊）, 中心實驗室（王佳慧）

梁平平 住院醫師 碩士 主要從事心肌缺血再灌注損傷的研究 Email:liangpingping1019@163.com 通訊作者：楊軍Email:yangjun19640124@163.com

R541

A

1000-3614（2017）03-0279-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.03.017

方法： 以pcDNA4為基因載體，構建pcDNA4-FGF21質粒并轉染H9c2大鼠心肌 細胞48h，加入衣霉素（TM）10 μM處理24h構建內質網應激模型，實驗分為4個組：對照組、衣霉素處理組、pcDNA4-FGF21 +衣霉素組、pcDNA4 + 衣霉素組。利用蛋白免疫印跡（Western blot）方法檢測FGF21蛋白及蛋白激酶R樣ER激酶（PERK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）介導的凋亡通路相關蛋白的表達。利用CCK8檢測細胞存活率和TUNEL檢測細胞凋亡率。

結果：成功構建pcDNA4-FGF21質粒并在H9c2細胞中過表達。與對照組相比，衣霉素處理組和pcDNA4 + 衣霉素組明顯上調H9c2細胞內源性FGF21的表達（P＜0.01），以及增加PERK和JNK介導的凋亡通路相關蛋白的表達（P＜0.05～0.01），減少細胞存活率和提高細胞凋亡水平（P＜0.05～0.01）。與衣霉素處理組和pcDNA4 + 衣霉素組相比，在pcDNA4-FGF21 +衣霉素組明顯降低PERK和JNK介導的凋亡通路相關蛋白的表達，增加細胞存活率，降低細胞凋亡水平（P＜0.05～0.01）。

結論： FGF21過表達可以減輕內質網應激誘導心肌細胞的凋亡，其機制可能部分與抑制內質網應激中PERK和JNK介導促凋亡通路的信號傳導有關。