環磷酸腺苷信號對矽肺纖維化形成的影響*

丁詠偉，耿玉聰，劉燕，徐洪，張麗娟，王瑞雪，王建輝，胡啟峰，楊方

（華北理工大學 1.基礎醫學院，2.醫學實驗中心，河北 唐山 063009；3.河北省唐山市第二醫院 創傷科，河北 唐山 063000）

環磷酸腺苷信號對矽肺纖維化形成的影響*

丁詠偉1，耿玉聰1，劉燕1，徐洪2，張麗娟2，王瑞雪1，王建輝1，胡啟峰3，楊方1

（華北理工大學 1.基礎醫學院，2.醫學實驗中心，河北 唐山 063009；3.河北省唐山市第二醫院 創傷科，河北 唐山 063000）

目的觀察環磷酸腺苷（cAMP）信號在大鼠矽肺纖維化發生、發展過程中的變化及其對矽肺纖維化形成的影響。方法 采用HOPE-MED8050動式染塵控制系統復制大鼠矽肺模型，雄性Wistar大鼠隨機分為6組，每組10只，分別染塵0、2、4、8、12和16周。采用Masson三色染色觀察肺組織形態，采用免疫組織化學法染色和Western blot檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）、纖連蛋白（Fn）、激動型G蛋白α（Gαs）、抑制型G蛋白α（Gαi2、Gαi3）及cAMP的表達。結果 Masson三色染色顯示，矽肺模型4周組細胞性結節區域可見藍紫色膠原沉積，并隨模型制備時間的延長纖維化病變區域膠原沉積逐漸增加。免疫組織化學法染色顯示，對照組α-SMA陽性表達部位在氣管及血管平滑肌；在矽肺模型16周組，α-SMA表達于結節周邊及間質纖維化病變區域。α-SMA、CollagenⅠ、Fn及Gαi2、Gαi3蛋白表達在矽肺模型4、8、12和16周較對照組逐漸增多。在矽肺模型8周組Gαs蛋白表達及cAMP含量較對照組下降，至染塵16周達最低。結論 cAMP的表達在矽肺發生、發展過程中呈下降趨勢，cAMP信號參與大鼠矽肺纖維化過程。

矽肺病；肌成纖維細胞；環磷酸腺苷

塵肺病（包括矽肺）是由于在職業活動中長期吸入生產性粉塵并在肺內潴留，而引起的以肺組織纖維化為主的全身性疾病。對塵肺發生、發展和防治機制的研究，一直是我國職業病研究領域中的難點及熱點問題。課題組以往研究發現，β2腎上腺素受體-激動型G蛋白（β2 adrenergic receptor-stimulatory G protein，ADRB2-Gs）復合物在矽肺模型組中表達下調，僅為對照組的30%[1]。研究表明，ADRB2-Gs復合物能夠促進腺苷酸環化酶（adenylyl cyclase，AC）表達的上調，調節環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的合成[2]。相關研究報道，cAMP信號在心、肺、肝等纖維化模型中具有抗纖維化的作用，cAMP表達的上調能夠限制炎癥反應，抑制成纖維細胞的增殖，阻斷成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉變，減輕細胞外基質的沉積[3-5]。由此可見cAMP信號可能具有潛在的抗矽肺纖維化的效果。本研究通過復制矽肺大鼠模型，分析肺組織中cAMP信號的動態變化與矽肺纖維化病變的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3周齡雄性Wistar大鼠（50±10）g（北京維通利華動物技術有限公司），SiO2粉塵（美國Sigma-Aldrich公司），Masson三色染色試劑盒（臺灣貝索公司），α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔多克隆抗體（ab32575，美國EPITMICs公司），Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）兔多克隆抗體（ab34710，英國Abcam公司），纖連蛋白（Fibronectin，Fn）兔多克隆抗體（ab45688，美國EPITMICs公司），抑制型G蛋白α（inhibitory G protein α，Gαi2）兔多克隆抗體（sc-7276，美國Santa Cruz公司），Gαi3鼠單克隆抗體（sc-365422，美國Santa Cruz公司），激動型G蛋白α（stimulatory G protein α，Gαs）鼠單克隆抗體（sc-135914，美國Santa Cruz公司），cAMP兔多克隆抗體（EL140118，英國Eterlife公司），免疫組織化學法二步法試劑盒（PV-6000，北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

HOPE-MED8050動式染塵控制系統（天津開發區合普工貿有限公司），光學顯微鏡（日本Olympus公司），凝膠成像分體系統（美國Biorad公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型復制與標本處理 HOPE-MED8050動式染塵控制系統參數：染毒室容積0.3 m3，柜內溫度20～25℃，濕度70%～75%，壓力-50～50 Pa，氧氣濃度20%，進氣流速3.0～3.5m3/h，粉塵進入速度為2.0～2.5 ml/min，柜內粉塵質量濃度為2 000 mg/m3。健康雄性Wistar大鼠60只隨機分對照組、2周組、4周組、8周組、12周組、16周組，每組10只。每只動物染塵3 h/d，至相應時段處死大鼠，對照組不染塵，常規喂養16周后處死。取右下肺放入4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，5μm連續切片。其余肺組織放入液氮速凍后，置入-80℃冰箱冷凍保存。

1.3.2 Masson三色染色觀察肺組織病理形態 石蠟切片常規脫蠟至水。Weigert鐵蘇木素染5～10 min，流水沖洗。1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數分鐘。麗春紅酸性品紅染液染5～10 min，蒸餾水稍洗。磷鉬酸溶液短時處理約1 min，直接用苯胺藍染液復染1～2 min。無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3.3 免疫組織化學染色檢測大鼠肺組織α-SMA蛋白的定位表達 石蠟切片脫蠟至水。0.3%雙氧水H2O2室溫封閉內源性過氧化物酶15 min。枸櫞酸鹽高壓修復抗原。滴加一抗（α-SMA為1∶200），4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗3次，5 min/次。滴加通用型二抗（羊抗兔/鼠）37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次,細胞色素氧化酶二氨基聯苯胺顯示法顯色，蘇木素復染細胞核，流水返藍，脫水透明中性樹膠封片。

1.3.4 Western blot檢測α-SMA、CollagenⅠ、Fn、Gαs、Gαi2/3及cAMP的含量 稱取50 mg肺組織，加入500 μl含蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀測定裂解液，充分剪碎勻漿，冰上超聲震蕩使蛋白解交聯，4℃、12 000 r/min離心15 min，提取上清蛋白，5×上樣緩沖液配蛋白。進行上樣電泳及電轉。一抗（CollagenⅠ、α-SMA、Fn、β-actin抗體1∶500稀釋；Gαs、Gαi2、Gαi3抗體1∶200稀釋）4℃孵育過夜，二抗溶液（1∶5 000稀釋），37℃孵育30 min，增強化學發光試劑顯色，采用Image-Proplus圖像處理軟件對條帶進行分析，以目的蛋白光密度值與內參蛋白光密度值的比值作為該蛋白的相對表達量。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，進行完全隨機設計的單因素方差分析（One-way ANOVA），進一步兩兩比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 矽肺大鼠肺組織Masson染色 （×200）

圖2 矽肺大鼠α-SMA的表達 （免疫組織化學法×200）

2 結果

2.1 肺組織形態學改變

Masson三色染色顯示，自矽肺模型4周組細胞性結節形成區域出現藍紫色膠原沉積，矽肺模型8周和12周組大鼠肺組織可見肺泡間隔增寬明顯，且細胞性結節數量增多，可見部分細胞性結節的融合。矽肺模型16周組肺組織內可見多個細胞性結節的融合和間質纖維化的形成，并可見細胞纖維性矽結節的形成，隨模型復制時間的延長纖維化病變區域膠原沉積逐漸增加。見圖1。

2.2 大鼠肺組織α-SMA蛋白的定位表達

免疫組織化學法結果顯示，在對照組α-SMA陽性表達于氣管及血管平滑肌。在矽肺模型16周組α-SMA標記的肌成纖維細胞主要位于結節周邊及間質纖維化病變區域。見圖2。

2.3 大鼠肺組織CollagenⅠ、α-SMA及Fn蛋白表達的變化

Western blot結果顯示，大鼠矽肺組織中CollagenⅠ、α-SMA及Fn的蛋白表達自模型4周組開始上調，其中，CollagenⅠ在矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組的表達分別是對照組2.17、3.00、4.12和5.71倍，差異有統計學意義（P＜0.05）。矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組α-SMA的表達分別是對照組1.81、3.08、3.87和4.95倍，差異有統計學意義（P＜0.05）。Fn在矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組的表達分別為對照組的2.00、3.92、5.15和6.88倍，差異有統計學意義（P＜0.05）。矽肺模型2周組、4周組、8周組、12周組及16周組組間比較，CollagenⅠ、α-SMA及Fn蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1和圖3。

表1 矽肺大鼠CollagenⅠ、α-SMA及Fn的表達變化（n=10，±s）

表1 矽肺大鼠CollagenⅠ、α-SMA及Fn的表達變化（n=10，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與2周組比較，P＜0.05；3）與4周組比較，P＜0.05；4）與8周組比較，P＜0.05；5）與12周組比較，P＜0.05

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圖3 矽肺大鼠CollagenⅠ、α-SMA及Fn的表達

2.4 大鼠肺組織Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP蛋白表達的變化

Western blot檢測結果顯示，Gαs蛋白表達在矽肺模型8周組、12周組及16周組逐漸下降，分別是對照組的52.46%、43.17%和22.95%，差異有統計學意義（P＜0.05）。cAMP的含量在矽肺模型8周組、12周組及16周組分別是對照組的63.53%、61.187% 和44.71%，差異有統計學意義（P＜0.05）。Gαi2、Gαi3蛋白表達在矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組逐漸升高，其中Gαi2蛋白表達分別是對照組的3.20、4.30、6.80和7.70倍；與對照組比較，Gαi3蛋白表達分別是其2.15、2.92、3.58和4.15倍，差異有統計學意義（P＜0.05）。矽肺模型2周組、4周組、8周組、12周組及16周組各組間比較，Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP的表達差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2和圖4。

表2 矽肺大鼠Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP的表達變化 （n=10，±s）

表2 矽肺大鼠Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP的表達變化 （n=10，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與2周組比較，P＜0.05；3）與4周組比較，P＜0.05；4）與8周組比較，P＜0.05；5）與12周組比較，P＜0.05

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圖4 矽肺大鼠Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP的表達

3 討論

目前研究認為，肌成纖維細胞是導致肺組織彌漫性纖維化的主要效應細胞，在肺纖維化時肌成纖維細胞可來自肺間質成纖維細胞的轉化[6]，內皮細胞間質轉化[7]，上皮-間質轉化[8]，周細胞[9]或胸膜間皮細胞[10]的轉化。無論何種來源，肌成纖維細胞都能特異性表達α-SMA。本研究中免疫組織化學染色顯示，在矽肺模型組16周組中，α-SMA標記的肌成纖維細胞位于結節周邊及間質纖維化區域，Westernblot檢測結果顯示，與對照組比較，矽肺模型組4～16周組α-SMA蛋白表達逐漸升高。提示矽肺模型中有大量活化的肌成纖維細胞。Masson三色染色顯示，在結節及纖維化病變區域出現藍紫色膠原沉積，并隨染塵時間的延長膠原沉積逐漸增加。同時肺組織Collagen I、Fn的蛋白表達自矽肺模型4周組開始上調，至矽肺模型16周組達最高，提示隨模型制備時間的延長，細胞外基質的生成逐漸增高。以上結果表明，經HOPE-MED8050動式染塵系統成功復制矽肺大鼠模型，矽肺病變進行性加重。

第二信使cAMP廣泛參與細胞多種功能的調控。cAMP是鳥苷酸結合蛋白信號級聯的第二信使。活化的Gαs可激活AC催化腺嘌呤核苷三磷酸產生cAMP；相反，激活的Gαi則抑制AC活性，導致cAMP水平降低。另外，cAMP的濃度還與磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）有關，PDE可催化cAMP水解，進而減弱或終止cAMP信號分子的作用。研究報道，偶聯到Gαs的受體，如腺苷A2B受體，通過增加cAMP產生，可抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，并減少膠原合成[11]。Gαi2G184S突變小鼠Gαi2信號表達增強，其心肌成纖維細胞增殖和膠原纖維基因表達明顯增強[12]。Gαi2缺陷小鼠在脂多糖誘導的肺損傷中巨噬細胞的聚集減少，且降低RAW 264.7細胞的運動和遷移[13]。本研究表明，Gαs/Gαi平衡可通過調節cAMP水平，抑制細胞外基質的分泌、肌成纖維細胞轉化及炎癥反應。另有研究顯示，采用AC活化劑/PDE抑制劑等均能夠有效抑制成纖維細胞增殖和細胞外基質成分的合成[14-15]。以上研究提示，Gαs/Gαi-cAMP信號對纖維化疾病具有重要的調控作用。

在本研究中，Gαs蛋白表達在矽肺模型4周組開始逐漸下降，至16周組達最低，cAMP在肺組織中的變化與Gαs蛋白一致，而Gαi2/3蛋白表達在矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組逐漸升高，并伴隨α-SMA、CollagenⅠ和Fn蛋白表達的上調。綜合以上結果，cAMP信號在大鼠矽肺纖維化的發生、發展過程中逐漸減弱，cAMP信號的低表達促進矽肺的發展。

[1]徐洪.Ac-SDKP抗矽肺纖維化作用的新靶向—肌成纖維細胞分化和差異蛋白的篩選[D].石家莊：河北醫科大學,2012.

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（童穎丹 編輯）

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Influence of cAMP signal on pathogenesis of silicotic fibrosis*

Yong-wei Ding1,Yu-cong Geng1,Yan Liu1,Hong Xu2,Li-juan Zhang2, Rui-xue Wang1,Jian-hui Wang1,Qi-feng Hu3,Fang Yang1
(1.Basic Medical College;2.Research Center of Medical Experiment,North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063009,China;3.Department of Trauma, the Second Hospital of Tangshan City,Tangshan,Hebei 063000,China)

ObjectiveTo observe the changes of cyclic adenosine monophosphate(cAMP)signal in pathogenesis and development of silicotic fibrosis.Methods A HOPE-MED8050 exposure control apparatus was used to copy the silicosis model.Male Wistar rats were randomly divided into 6 groups (10 in each group) and the rats inhaled dust respectively for 0,2,4,8,12 and 16 w.Masson trichrome staining was performed to observe the histomorphology of the lung tissues.The expressions of α smooth muscle actin (α-SMA),collagenⅠ,fibronectin (Fn),stimulatory G protein α (Gαs),inhibitory G protein α (Gαi2/3)and cAMP were detected by immunohistochemistry and Western blot respectively.Results Masson trichrome staining revealed bluish-purple collagen deposition in the 4-w silicosis group,and the collagen deposition in the fibrotic lesions increased with the time of exposure to silica.Immunohistochemical results showed that in the control group positive α-SMA expression was seen in the trachea and vascular smooth muscles,while in the 16-w silicosis group α-SMA was observed around the fibrotic nodules and in the interstitial fibrotic area.The expressions of α-SMA,collagen I,Fn and Gαi2/3 proteins gradually increased in the 4-w,8-w,12-w and 16-w silicosisgroups compared with the control group.As compared to the control group,the expressions of Gαs and cAMP significantly decreased in the 8-w silicosis group,and were the lowest in the the 16-w silicosis group. Conclusions cAMP expression decreases along with the pathogenesis and development of silicosis,and cAMP has a significant role in silicotic formation.

silicosis;myofibroblast;cyclic adenosine monophosphate

R135.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.001

1005-8982（2017）06-0001-05

2016-05-05

國家自然科學基金（No：81472953）；河北省自然科學基金青年基金（No：H2016209161）；華北理工大學大學生創新計劃（No：X2016218）

劉燕，E-mail：liuyan.zone@163.com；Tel：13582526275