慢病毒轉染和電轉染原代C57BL/6小鼠神經干細胞的比較*

加三三，胡俊，李美寧，張凱麗，劉志貞

（山西醫科大學 生物化學與分子生物學實驗室，山西 太原 030001）

慢病毒轉染和電轉染原代C57BL/6小鼠神經干細胞的比較*

加三三，胡俊，李美寧，張凱麗，劉志貞

（山西醫科大學 生物化學與分子生物學實驗室，山西 太原 030001）

目的比較慢病毒與電轉染兩種技術轉染小鼠原代神經干細胞的優劣，獲得神經干細胞高效轉染的方法。方法 從C57BL/6小鼠腦組織中提取神經干細胞，進行原代培養；分別進行慢病毒轉染和電轉染，通過觀察綠色熒光蛋白在細胞中的表達，比較兩種轉染方法的轉染效果，并用噻唑藍（MTT）法計算相對存活率，比較兩種方法轉染后對細胞的影響。結果 慢病毒與電轉染兩種轉染技術轉染神經干細胞48 h后，慢病毒的轉染率為（77.6±6.6）%，高于電轉染法轉染率[（29.2±4.8）%]，兩者比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；轉染72 h后，慢病毒轉染的細胞熒光表達量為（60.0±3.6）%，電轉染細胞的熒光表達量僅剩（12.8±2.4）%；MTT法結果顯示，電轉染組細胞相對存活率為（75.8±2.3）%，慢病毒轉染組細胞相對存活率為（70.1±1.4）%，兩者比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 對于原代神經干細胞轉染，慢病毒轉染法比電轉染法具有更高的轉染效率及長久穩定性，轉染后細胞存活率與電轉染法接近，因此慢病毒轉染法更能滿足研究者的需求。

神經干細胞；慢病毒轉染；電轉染

神經干細胞可分化為神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞等，是研究和治療神經系統疾病的重要模型。由于神經干細胞特殊的成球懸浮生長方式及干細胞膜的特異性，使外源基因轉染神經干細胞成為一個研究課題。本實驗將采用慢病毒和電穿孔兩種技術轉染C57BL/6小鼠原代神經干細胞，比較轉染效率、長期表達的穩定性、安全性，探索一種適合體外轉染神經干細胞的最佳方法，為進一步研究神經干細胞基因轉染及干細胞移植提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 神經干細胞的提取及原代培養

取懷孕14.5 d的C57BL/6孕鼠，解剖并取出胎鼠，在解剖顯微鏡下取出腦組織，用機械法將腦組織攪碎，胰酶消化1～2 min，然后用300目濾膜過濾組織液，將濾液1 000 r/min離心5 min，去上層液，加入培養液重懸，轉移至培養瓶中培養。當細胞數量多，出現大量細胞球，細胞融合度為50%～70%時，開始進行傳代，當傳至第3代時做細胞轉染。分別做Nestin熒光染色鑒定，神經干細胞分化經膠質纖維酸性蛋白、神經微絲蛋白-H、半乳糖腦苷脂熒光染色鑒定，證實為神經干細胞（結果未顯示）。

1.2 慢病毒轉染

慢病毒載體為第2代慢病毒載體，由pMagic 4.1（包含有GFP表達基因）、慢病毒包裝質粒pCD/NLBH*DDD和膜蛋白表達質粒pLTR-G共轉染293T細胞，獲得病毒包裝后的重組慢病毒載體，由上海世翱生物醫藥公司構建。

將神經干細胞1 000 r/min離心5 min，用1 ml胰酶類似物TrypLE Express重懸，37℃消化3 min，使神經球消化成單個細胞。再次1000 r/min離心5min，收集細胞。加入1 ml培養液，重懸并細胞計數，24孔板每孔加入5×105個細胞。前期實驗已摸索出感染滴度的大致范圍，按照感染復數（multiplicity of infection，MOI）值40加入一定體積的病毒液，并加入500 μl培養液，按照1∶200的比例加入一定體積的Ploybrene轉染增強劑，放入培養箱中培養。24 h后離心細胞液，去含病毒的培養液，加入新鮮培養液繼續培養。48和72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達。

1.3 電轉染質粒

質粒由上海世翱生物醫藥公司構建提供，主要為pMAgic 4.1質粒。神經干細胞處理如上，加入一定量的電轉液重懸。所使用的電轉杯為20μl反應體系，20 μl電轉反應體系中保證含約3×106個細胞、500 ng重組質粒，再用電轉緩沖液補充體積至20 μl。將電轉杯放入電轉儀中，選擇電轉模式DS113進行電轉。將電轉后的細胞液加入到提前放入培養箱中孵育過的培養液中混勻，加入24孔板中培養，48和72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達。

1.4 轉染效率穩定性比較

轉染48 h后，在顯微鏡下任意選取多個視野，計算表達綠色熒光蛋白的細胞數與白光鏡下細胞數的比值，即轉染效率。通過對比轉染后48和72h細胞綠色熒光強弱變化，比較兩種轉染方法細胞內綠色熒光維持時間。

1.5 細胞存活實驗

經過不同轉染方法處理過的神經干細胞，加入到96孔板（5×103左右）中，并設立未經過轉染處理的神經干細胞作為陰性對照組，轉染48 h后，每孔加入約20 μl噻唑藍[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]，繼續培養約4h后離心棄上清液，每孔加入150μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），再充分振蕩10 min，使結晶物充分的溶解。570 nm波長測光密度（optical density，OD）時，用空白組調零，計算細胞的相對存活率。細胞相對存活率=（實驗孔OD值-空白組OD值）/（對照孔OD值-空白組OD值）×100%

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電轉法和慢病毒轉染法轉染結果比較

將狀態較好的神經干細胞接種到24孔板中，分別進行電轉染和慢病毒轉染，細胞轉染后48和72 h在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達。見圖1。

圖1 兩種技術轉染神經干細胞48和72 h后綠色熒光蛋白的表達 （×100）

圖2 兩種轉染方法48 h轉染效率比較

圖3 兩種轉染方法熒光蛋白表達持久性比較

圖4 兩種轉染方法細胞存活率比較

2.2 兩種方法轉染神經干細胞轉染效率的比較

轉染后表達綠色熒光蛋白的細胞為轉染成功的細胞。轉染48 h后，慢病毒轉染神經干細胞的效率為（77.6±6.6）%，電穿孔轉染效率為（29.2±4.8）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=10.372，P=0.023），慢病毒轉染效率更高。見圖2。

2.3 轉染穩定性比較

轉染72 h后，慢病毒轉染神經干細胞的效率為（60±3.6）%，電穿孔轉染效率為（12.8±2.4）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=18.827，P=0.049），慢病毒轉染表達的穩定性和持久性更好。見圖3。

2.4 細胞存活實驗結果

電轉染組細胞相對存活率為（75.8±2.3）%，慢病毒轉染組細胞相對存活率為（70.1±1.4）%，經t檢驗，差異無統計學意義（t=3.814，P=0.058）。見圖4。

3 討論

神經干細胞是一種懸浮于培養液中生長的多潛能干細胞，用普通的脂質體轉染方法很難進行有效的轉染。根據文獻檢索，慢病毒轉染和電轉染為目前神經干細胞備選的轉染方案[1-2]。其是高效的神經干細胞轉染方法，為中樞神經系統疾病的治療應用研究提供技術支持[3]，對于后期進行各項基因相關功能研究，以及信號通路研究具有重要的意義。

電穿孔轉化細胞的方法是利用瞬間高壓造成細胞膜不穩定，形成電穿孔使得DNA進入細胞。電穿孔轉染法是一種物理方法，無生物與化學毒性副作用，安全性高。電穿孔適用細胞范圍廣，特別是脂質體難以介導轉染的細胞，如干細胞等[4]。文獻檢索表明，對于神經干細胞來說，電穿孔的轉染效率明顯高于脂質體轉染[4-5]。

電穿孔操作方便，只需細胞和質粒即可，但需要專用設備而且轉染效率受多種因素，如電壓、脈沖時間、電穿次數等的影響，要確定神經干細胞的最佳轉染條件就必須對其進行優化。通過實驗確定合適的電壓和脈沖時間，使轉染效率才能達到最大。

本實驗電穿孔轉染效率數據有波動性，轉染效率低于相關研究[3-4]，其原因可能是神經球致密，雖經吹打，仍有大小及數量不等的細胞團，而且電穿孔是瞬時完成，質粒能否在在這一瞬間進入細胞具有一定的偶然性。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷病毒為基礎改造得到的基因治療載體，與傳統技術相比，具有轉染效率高、可以轉染分裂期和靜止期細胞的特點[6]，而且慢病毒轉染可以使目的基因整合至宿主細胞的染色體當中，穩定、持久的表達。

本研究通過機械法和酶法從孕14.5 d的胎鼠腦組織中提取、純化原代神經干細胞，并采用電穿孔法和慢病毒感染兩種方法將GFP基因表達載體轉入純化的神經干細胞。轉染48 h后觀察結果，可見慢病毒轉染神經干細胞的效率為（77.6±6.6）%，高于電穿孔轉染效率[（29.2±4.8）%]。轉染72 h后觀察神經干細胞熒光表達，發現慢病毒轉染組仍然能夠檢測到綠色熒光蛋白的表達，表達率為（60.0± 3.6）%，熒光表達減少22%。說明其轉染表達的穩定性與持久性，能滿足研究者的進一步研究需求。電轉染組熒光蛋白表達只剩（12.8±2.4）%，熒光表達減少56.2%，說明電轉染的穩定、持久性較差。

進一步用MTT法檢測兩種轉染方法對細胞存活率的影響，發現電轉染組細胞存活率為（75.8± 2.3）%，高于慢病毒轉染組的細胞存活率[（70.1± 1.4）%]，但是差異無統計學意義。

從電轉染和慢病毒轉染的操作而言，慢病毒轉染的實驗過程更加繁瑣。雖然轉染用的慢病毒屬于安全病毒，但是在實驗過程中也要注意實驗安全問題：①慢病毒轉染實驗最好在安全柜中進行，如果是在超凈臺中進行轉染實驗，則不能開吹風機，因為病毒很容易擴散到空氣中；②實驗中用過的槍尖、吹管等必須在84消毒液中浸泡消毒；③做完實驗后要用消毒液擦拭臺面，最好用紫外線照射30 min。而電轉染就沒有這么多的實驗細節要求，電轉染時，只需對電轉儀進行模式設定即可。由于轉染過程中細胞會變得比較脆弱，因此用于培養轉染后細胞的培養液都要事先放入細胞培養箱中孵育，對于青、鏈霉素比較敏感的細胞，則要用無青、鏈霉素的培養液進行培養。

由于神經干細胞在體外培養時容易聚成團，形成大的神經球，這會影響細胞的轉染效率。因此在進行轉染實驗之前，需要進行處理，將神經球處理成單個的懸浮細胞。轉染完成之后，經過12 h左右的培養，單個的神經干細胞又會聚團形成神經球，因此筆者會看到成團的發綠色熒光的神經球。轉染效率還受到神經干細胞狀態的影響，為獲得好的轉染效果，轉染用的細胞要盡可能挑狀態好的細胞。原代神經干細胞傳代次數多以后活力會下降，因此要盡量用3代以前的細胞進行轉染。

通過不斷地優化兩種轉染方法并進行比較發現，雖然慢病毒轉染后神經干細胞的存活率比電轉染略低，但是慢病毒轉染的效率更高而且持續時間較長，更能滿足研究者的需要，所以相對而言，慢病毒載體更適合用于神經干細胞的轉染。

[1]TANG Y,GARSON K,LI L,et al.Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine mediated transfection[J]. Oncology Letters,2015,9(1)：55-62.

[2]MCLENACHAN S,ZHANG D,PALOMO A B A,et al.mRNA transfection of mouse and human neural stem cell cultures[J]. PLoS One,2013,8(12)：DOI：10.1371/journal.pone.0083596.

[3]ARTEGIANI B,LANGE C,CALEGARI F.Expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection[J].Journal of Visualized Experiments：JoVE,2012,6(68)：3791-4093.

[4]ZHANG Y,LIU N,TANG Y,et al.Efficient generation of neural stem cell-like cells from rat adipose derived stem cells after lentiviral transduction with green fluorescent protein[J].Mol Neurobiol,2014,50(2)：647-654.

[5]HUGHES S M,MOUSSAVI-HARAMI F,SAUTER S L,et al. Viral-mediated gene transfer to mouse primary neural progenitor cells[J].Mol Ther,2002,5(1)：16-24.

[6]ZHU C H,LEI W,CHEN Z R.Construction of a lentiviral vector encoding heme oxygenase 1 and its introduction into mouse adipose tissue-derived stem cells[J].Genetics and Molecular Research：GMR,2015,14(3)：10705-10716.

（童穎丹 編輯）

Comparison of lentivirus transfection and electroporation transfection in primary neural stem cells of C57BL/6 mice*

San-san Jia,Jun Hu,Mei-ning Li,Kai-li Zhang,Zhi-zhen Liu
(Department of Biochemistry and Molecular Biology,Shanxi Medical University, Taiyuan,Shanxi 030001,China)

ObjectiveTo develop an efficient method to transfect mouse primary neural stem cells(NSCs). Methods Primary neural stem cellswereisolated from brain tissueof C57BL/6 mice,then,lentivirus transfection and electroporation methodswere used to transfectprimary NSCs.By observing the green fluorescent protein expression the transfection effect of the two methods was compared.The survival rate of primary NSCs was assessed using MTT method,the effect of the two methods on primary NSCs were compared.Results The rate of lentivirus transfection [(77.6±6.6)%]was higher than that of electroporation [(29.2±4.8)%,P＜0.05]48 h after transfection.After 72 h,the amount of green fluorescence expression was (60.0±3.6)%by lentivirus transfection and only(12.8±2.4)%by electroporation method.The survival rate of lentivirus transfection[(70.1±1.4)%]was not significantly lower than that of electroporation[(75.8±2.3)%,P＞0.05].Conclusions Lentivirus transfection is more efficient than electroporation for NSCs.

neural stem cell;lentivirus transfection;electroporation

R363

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.002

1005-8982（2017）06-0006-04

2016-10-19

國家自然科學基金（No：81300487）；山西省回國留學人員科研資助項目（No：2016-51）

劉志貞，E-mail：zhizhenliu2013@163.com；Tel：15034198990