RegⅣ、EGFR和Survivin在結直腸腺瘤癌變過程中的表達及意義*

王林娜，張清泉，侯素平，劉洪博

（河北省衡水哈勵遜國際和平醫院，河北 衡水 053000）

RegⅣ、EGFR和Survivin在結直腸腺瘤癌變過程中的表達及意義*

王林娜，張清泉，侯素平，劉洪博

（河北省衡水哈勵遜國際和平醫院，河北 衡水 053000）

目的研究再生基因Ⅳ（RegⅣ）、表皮生長因子受體（EGFR）及Survivin在結直腸腺瘤癌變過程中的表達，并分析其與結直腸腺瘤及結直腸癌臨床病理特征的關系。方法 采用免疫組織化學結合組織芯片法檢測結直腸正常黏膜（150例）、腺瘤（77例）、結直腸癌（150例）RegⅣ、EGFR及Survivin的表達，并分析其與臨床病理特征的關系。結果 RegⅣ、EGFR、Survivin在結直腸正常黏膜、腺瘤及癌組織中，表達逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。RegⅣ、Survivin與結直腸腺瘤大小及分級相關，EGFR僅與腺瘤的分級相關；RegⅣ、EGFR與結直腸癌的分化程度、淋巴結轉移及TNM分期密切相關，Survivin與結直腸癌的淋巴結轉移及TNM分期密切相關（P＜0.05），而3者與結直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤大小及浸潤深度無關（P＞0.05）。結直腸腺瘤組織內RegⅣ、EGFR、Survivin 3者無相關性（P＞0.05）；結直腸癌組織內RegⅣ與EGFR、RegⅣ與Survivin、EGFR與Survivin表達呈正相關（P＜0.05）。結論 RegⅣ、EGFR及Survivin在結直腸腺瘤癌變過程中逐漸升高，提示3者共同參與結直腸腺瘤癌變的發生，且與結直腸癌的TNM分期密切相關，聯合檢測有利于對結直腸癌的預后進行評估，并為研發靶向藥物提供理論支持。

結直腸腺瘤；癌變；再生基因Ⅳ；表皮生長因子受體；Survivin；組織芯片

結直腸癌是消化系統惡性腫瘤之一，發病率居我國惡性腫瘤的第1位[1]，在美國發病率與病死率均居第3位[2]。研究結直腸癌的發病機制對其預防、治療及預后均有重要意義。結直腸癌發生機制復雜，其中腺瘤癌變是已被廣泛認可的途徑之一，但其機制目前尚不明確。再生基因Ⅳ（regenerating islet-derived family memberⅣ，RegⅣ）是再生基因家族最小的一員，參與多種惡性腫瘤的形成，如胰腺癌[3]，胃癌[4]，結直腸癌等[5]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）參與多條與結直腸癌有關的信號通路，同時EGFR/Akt通路下游因子生存素（Survivin）是凋亡抑制家族（inhibitor of apotosis，IAP）效力最強的成員，兩者與結直腸癌密切相關。BISHNUPURI等[6]研究發現，RegⅣ發揮著類似表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）的功能，可與EGFR結合，上調Survivin的表達，參與結直腸癌的發生、發展。本研究旨在通過組織芯片結合免疫組織化學法，檢測RegⅣ、EGFR及Survivin在結直腸腺瘤癌變過程中的表達及其相關性，并分析3者與臨床病理特征的關系，以探討3者在結直腸腺瘤癌變過程中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年1月-2015年12月本院結直腸癌患者手術標本及腸鏡結直腸腺瘤病理標本。所有病理切片由兩位高年資病理醫師嚴格按照2000年世界衛生組織標準進行明確診斷，選擇結直腸正常黏膜（150例）、腺瘤（77例）、結直腸癌（150例）為研究對象。患者術前均未接受抗腫瘤治療。結直腸癌患者中男性98例，女性52例；年齡18～90歲，中位年齡64歲；組織學分級：高分化28例，中分化80例，低分化42例；浸潤未達全層44例，全層106例；淋巴結未轉移84例，轉移66例；病理分期（pTNM分期）：Ⅰ期34例，Ⅱ期57例，Ⅲ期53例，Ⅳ期6例。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織芯片復制 顯微鏡下在蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）切片上標記，選取結直腸癌組織和正常組織各2點，并在蠟塊對應位置上標記。取組織芯片空白蠟塊，用骨髓穿刺針在蠟塊上打孔，將標記好的組織用骨髓穿刺針穿取，并按設計的排列順序裝載在空白蠟塊中。將組織芯片蠟塊左上角位點放置腸壁平滑肌組織作為標記。制備好的蠟塊在52℃烤箱中加熱融合，冷卻備用。

1.2.2 免疫組織化學法染色 組織芯片蠟塊行4 μm連續切片，60℃恒溫烤箱烤片60 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3%過氧化氫室溫10 min阻斷內源性過氧化物酶，分別用檸檬酸鹽緩沖液高壓修復RegⅣ和EDTA高壓修復EGFR、Survivin，山羊血清室溫封閉20 min，一抗4℃過夜（RegⅣ稀釋1∶100；EGFR、Survivin工作液），二抗37℃恒溫箱內40 min。二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復染。每批均設陽性切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖溶液替代一抗作為陰性對照。RegⅣ兔抗多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，EGFR兔抗單克隆抗體、Survivin兔抗多克隆抗體、即用型SP通用試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 結果判定

RegⅣ和Survivin定位于細胞漿，EGFR陽性表達于細胞膜，染色結果依據染色強度和陽性細胞數評分。即隨機選取10個高倍鏡視野，計數陽性細胞百分比的平均數，陽性細胞數計分：無為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；著色強弱計分：無為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以陽性細胞數計分和著色強弱計分的乘積評定，≤3分者為陰性，＞3分者為陽性。染色結果均由2位病理醫師雙盲評估。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計數資料以率表示，用χ2檢驗；相關性分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RegⅣ、EGFR和Survivin在結直腸正常黏膜、腺瘤及癌組織內的表達

RegⅣ、Survivin蛋白陽性表達定位于細胞漿，EGFR主要表達于細胞膜和/或細胞漿。在結直腸正常黏膜、腺瘤及癌組織中RegⅣ陽性表達率分別為3.3%、33.8%和52.0%；EGFR陽性表達率分別為5.3%、35.1%和59.3%；Survivin陽性表達率分別為2.7%、40.3%和64.7%。RegⅣ、EGFR和Survivin 3者在結直腸正常黏膜、腺瘤及癌組織內表達逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1和圖1～3。

圖1 RegⅣ在結直腸正常黏膜、腺瘤及癌組織的表達 （×200）

圖2 EGFR在結直腸正常黏膜、腺瘤及癌組織的表達 （×200）

圖3 Survivin在結直腸正常黏膜、腺瘤及癌組織的表達 （×200）

表1 結直腸正常黏膜、腺瘤及癌組織RegⅣ、EGFR、Survivin的表達 例（%）

2.2 RegⅣ、EGFR和Survivin表達與結直腸腺瘤臨床病理特征的關系

RegⅣ與結直腸腺瘤的大小及分級相關（χ2= 4.900和8.183，P=0.027和0.004），Survivin與結直腸腺瘤的大小及分級相關（χ2=5.402和5.998，P= 0.020和0.014），EGFR僅與結直腸腺瘤的分級相關（χ2=4.663，P=0.031）；而3者與患者的性別、年齡、腺瘤的部位及類型無關（P＞0.05）。

2.3 RegⅣ、EGFR和Survivin表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

RegⅣ、EGFR與結直腸癌的分化程度、淋巴結轉移及TNM分期相關（P＜0.05），Survivin與結直腸癌的淋巴結轉移及TNM分期相關（P＜0.05）；3者與患者的性別、年齡、腫瘤大小及浸潤深度無關（P＞0.05）。見表2。

2.4 RegⅣ、EGFR和Survivin在結直腸腺瘤及癌組織內表達的相關性

Spearman相關性分析結果顯示，在結直腸癌組織內，RegⅣ與EGFR、EGFR與Survivin、RegⅣ與Sur-vivin呈正相關（r=0.427、0.439和0.267，P=0.000、 0.000和0.001）。

表2 臨床病理特與RegⅣ、EGFR及Survivin在結直腸癌組織中表達的關系 例（%）

3 討論

結直腸癌是我國最常見的消化系統惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康和生活質量，但其發病機制尚不明確[1]。正常黏膜-腺瘤-癌的發生順序被多數學者認可，系統研究該順序內基因或蛋白的改變，對探索腺瘤癌變及結直腸癌發生機制可能有重要作用。RegⅣ是再生基因家族新近發現的一員，參與多種惡性腫瘤的發生，尤其是胃腸道的腫瘤，但在結直腸腺瘤癌變內的研究目前較少。ZHANG等[7]構建結腸正常黏膜-腺瘤的差減文庫，RegⅣ被篩選13次，通過逆轉錄聚合酶鏈反應、Northern、原位雜交檢測12例癌與腺瘤并存的患者，RegⅣ在腺瘤組織內表達均顯著升高，并且在腺瘤癌變組織中豐度最高[8]，提示RegⅣ在結直腸腺瘤癌變過程中發揮一定的作用，檢測腺瘤內RegⅣ水平，可能預示其更有癌變的趨勢。ZHU[9]和SAWADA等[10]認為，RegⅣ過表達預示著結直腸癌患者有更差的預后，本實驗結果顯示，RegⅣ在正常黏膜-腺瘤-癌這一發生過程中表達逐步升高，3者比較差異有統計學意義；且RegⅣ與結直腸癌的臨床特征相關性分析顯示，其與組織學分化、淋巴結轉移及臨床分期密切相關，與ZHU[9]及KAWASAKI等[11]研究結果一致。

EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體，參與細胞內多種信號轉導途徑，與細胞的增殖、分化及凋亡密切相關，同時EGFR在多種腫瘤發生過程中發揮重要作用。EGFR也參與結直腸腺瘤癌變該過程。IVANCIC等[12]通過檢測APC pirc/+小鼠血漿內EGFR濃度發現，EGFR濃度與結腸腺瘤形成有較好的相關性。LEUNG等[13]檢測氧化偶氮甲烷處理的小鼠亦發現，EGFR與結腸腺瘤的發生率密切相關。ISIDRO等[14]通過免疫組織化學法檢測發現，結直腸癌組織內的EGFR表達顯著高于正常黏膜。崔紅霞等[15]檢測發現，結直腸癌組織內EGFR的表達顯著高于正常黏膜及腺瘤組織，且EGFR的表達與結直腸癌的組織學分級相關。本實驗中EGFR在結直腸正常黏膜-腺瘤-癌組織內表達逐步升高，且差異有統計學意義，提示EGFR在結直腸腺瘤癌變過程中發揮一定作用。EGFR與臨床病理特征相關性分析顯示，其與癌組織的分化程度及淋巴結轉移、腫瘤臨床TNM分期關系密切，題示預后較差。目前臨床已常規檢測腫瘤組織內EGFR的表達情況，提示預后并且指導用藥。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的一員，也是目前發現凋亡作用最強因子，可通過多種途徑抑制細胞凋亡，參與腫瘤的發生。趙成鵬[16]通過免疫組織化學法分析結直腸腺瘤及癌組織內Survivin的表達，結果顯示，其在結直腸正常黏膜、腺瘤及癌組織內表達差異有統計學意義；并提出在檢測腺瘤伴低級別內瘤變時，若Survivin為陽性，則提示其正在進展期，應密切隨診。ADAMKOV等[17]檢測結直腸腺瘤伴高級別內瘤變及伴低級別內瘤變內Survivin的表達情況，發現前者要明顯高于后者，Survivin的表達與腺瘤的大小，分級及部位相關。筆者實驗檢測結直腸正常黏膜、腺瘤及癌組織內Survivin的表達差異有統計學意義，并且Survivin與淋巴結轉移及臨床分期相關，與上述結果一致，說明Survivin參與結直腸腺瘤癌變的過程，同時提示預后不良。Survivin在正常成熟組織內基本不表達，而在結直腸癌組織內過表達，筆者可通過這一特性，設計有關于Survivin的靶向藥物。MOBAHAT等[18]也認為Survivin可以作為癌癥治療優先選擇的靶向藥物。

BISHNUPURI等[6]發現，HCT116和HT29細胞系對rhR4反應與加入EGF后的反應相似，推測RegⅣ可能是通過EGFR/Akt/AP-1通路發揮作用。RTPCR及Western blot檢測顯示，加入rhR4后，可導致Survivin的表達升高，推測RegⅣ、EGFR及Survivin 3者可能存在信號通路的交匯，并互相影響。筆者通過組織芯片結合免疫組織化學法，檢測結直腸正常黏膜、腺瘤、癌組織內RegⅣ、EGFR、Survivin的表達，3者的表達逐步升高，且差異有統計學意義；同時在結直腸腺瘤內，伴有高級別內瘤變的表達率要高于伴有低級別內瘤變的組織，說明3者在腺瘤時期表達也在發揮促進癌變的作用。在分析3者在癌組織內相關性時發現，3者兩兩呈正相關，但在腺瘤內未發現相關性，說明可能在結直腸癌發生早期，3者在各自發揮作用，到腺瘤癌變后，才通過某些其他因子發生連系。同時，3者與臨床病理特征的相關性也說明可通過檢測RegⅣ、EGFR、Survivin的表達，來預測結直腸癌患者的預后，并對指導臨床靶向藥物治療有重要意義。

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（童穎丹 編輯）

Expression and significance of RegⅣ,EGFR and survivin in canceration of colorectal adenoma*

Lin-na Wang,Qing-quan Zhang,Su-ping Hou,Hong-bo Liu
(Harrison International Peace Hospital,Hengshui,Hebei 053000,China)

ObjectiveTo investigate the expressions of regenerating islet-derived family memberⅣ (RegⅣ), epidermal growth factor receptor (EGFR)and survivin in canceration of colorectal adenomas and analyze the correlations with clinicopathological features.Methods Immunohistochemistry combined with tissue microarray was used to detect the expressions of RegⅣ,EGFR and survivin in normal colorectal mucosa from 150 cases, colorectal carcinomas from 150 cases,and adenomas from 77 cases.The relationships among RegⅣ,EGFR, survivin and clinicopathological features were statistically analyzed.Results The positive rates of RegⅣ,EGFR and survivin in the colorectal adenomas and the colorectal carcinomas were significantly higher than those in the normal mucosa(P＜0.05).The expressions of RegⅣ and survivin were positively correlated with adenoma size and degree of dysplasia,while EGFR only correlated with dysplasia grade of adenomas.The expressions of RegⅣ and EGFR in the colorectal carcinomas were significantly correlated with differentiation,lymph node metastasis and TNM stage,while the expression of survivin had positive correlations to lymph node metastasis and TNM stage(P＜0.05),but none of them was associated with patients'gender,age,tumor size or depth of invasion (P＞0.05).There was no correlation among RegⅣ,EGFR and survivin expressions in the adenomas, while the RegⅣ,EGFR and survivin expressions in the colorectal carcinomas were positively correlated (P＜0.05).Conclusions RegⅣ,EGFR and survivin are up-regulated in colorectal adenomas and carcinomas,which indicates that they may play important roles in the canceration of colorectal adenomas and are closely correlated to TNM staging of colorectal carcinomas.Combined detection of the three markers possibly has certain referential value in evaluation of the prognosis of colorectal adenomas and carcinomas,and in developing the target medicine for colorectal carcinomas.

colorectal adenoma;carcinogenesis;regenerating islet-derived family memberⅣ;epidermal growth factor receptor;survivin;tissue microarray

R735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.009

1005-8982（2017）06-0044-06

2016-06-07

河北省衛生廳醫學科學重點課題（No：20130341）