明日葉不同極性溶劑萃取物的活性研究

朱 芳韋萬麗 杜 瑩 陳 婷 周清娣 廖莉玲

(1. 貴州師范大學化學與材料科學學院，貴州 貴陽 550001；2. 悉尼大學化學學院，澳大利亞 悉尼 2006)

明日葉不同極性溶劑萃取物的活性研究

朱 芳1韋萬麗1杜 瑩1陳 婷1周清娣2廖莉玲1

(1. 貴州師范大學化學與材料科學學院，貴州 貴陽 550001；2. 悉尼大學化學學院，澳大利亞 悉尼 2006)

為比較明日葉不同極性部位的活性，將明日葉粗提取物過HPD-600大孔樹脂，收集50%乙醇洗脫物。采用不同極性有機溶劑對50%洗脫物進行液—液萃取，將50%洗脫物分為乙酸乙酯相、正丁醇相、水相三個不同極性溶劑萃取物，測定不同極性溶劑萃取物的總黃酮和總多酚含量，研究各萃取物清除DPPH自由基、ABTS自由基能力和總還原能力以及對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。結果表明：乙酸乙酯相的總黃酮含量以及總多酚含量高于其他溶劑相，且體外抗氧化能力和對α-葡萄糖苷酶的抑制活性最強。明日葉不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性和對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨著濃度的增加而增加。

明日葉；抗氧化；α-葡萄糖苷酶；抑制活性

明日葉是一種芹科多年生草本植物，藥食兼用。原產于日本，因富含多種天然活性物質，被譽為“21世紀的健康食品”[1]。研究[2-4]表明明日葉富含的黃酮類物質具有抗癌、降血糖、抗衰老等功效。目前，已經有不少文獻[5-6]對明日葉總黃酮的提取和純化進行了報道，但鮮有文獻對明日葉的活性部位進行追蹤，而本研究擬采用簡便快捷的方法，先將明日葉粗提取物過HPD-600樹脂，再將大孔樹脂純化后的樣品分為乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水相部位，采用清除DPPH、ABTS自由基，總還原能力和對α-葡萄糖苷酶活性抑制的方法來評價明目葉不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性及對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，旨在追蹤明日葉的活性部位，為明日葉活性物質的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

明日葉：上海交通大學農業與生物學院種植實驗基地；

蘆丁標準品：分析純，貴州迪大科技有限責任公司；

二苯基苦味酰基苯肼：分析純，東京化成株式會社；

α-葡糖糖苷酶：100 U/mg，Sigma-Aldrich Company；

4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷：分析純，Sigma-Aldrich Company;

沒食子酸標準品：分析純，天津市科密歐化學試劑開發中心；

其余試劑均為分析純；

HPD-600樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；

分光光度計：L5s型，上海儀電分析儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52型，上海亞榮生化儀器廠；

電子天平：A200S型，德國sartorius公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備 將晾干的明日葉粉碎過40目篩，稱取60 g明日葉粉末與53%的乙醇按1∶17(g/mL)的料液比混勻，在82 ℃水浴提取兩次，每次2 h，合并兩次提取液，抽濾，50 ℃真空減壓濃縮至粉末狀得到粗品。取一定量的蒸餾水溶解粗品，配成總黃酮含量為2～3 mg/mL的溶液，以2 BV/h 的流速過HPD-600樹脂至樹脂吸附飽和后，用50%的乙醇溶液進行洗脫，直至洗脫液無色。收集洗脫液旋干得到大孔樹脂純化的樣品，將大孔樹脂未吸附的部分旋干得到過柱液樣品。將大孔樹脂純化后的樣品，加適量的蒸餾水溶解，充分混勻后轉移到分液漏斗中。依次用乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，旋干各相溶液分別得到乙酸乙酯相、正丁醇相、水相樣品，并按式(1)計算得率：

(1)

式中：

C——得率，%；

m1——旋干后各部分樣品質量，g；

m2——起始加入的明日葉粉末質量，g。

1.2.2 總黃酮含量的測定 采用NaNO2—Al(NO3)3比色法[7]。以蘆丁為標準品，在200～700 nm波長范圍掃描，確定其最大吸收波長為515 nm。在515 nm處測定標準系列的吸光度，并以吸光度(Y)對黃酮濃度(X)作圖，得回歸方程為：Y=11.466X-0.001 4，R2=0.999 9。按同樣方法測定不同溶劑萃取物樣品的吸光度，代入標準曲線方程，計算各溶劑萃取物樣品的總黃酮含量。

1.2.3 總多酚含量的測定 參考文獻[8]。以沒食子酸為標準品，在最大吸收波長769 nm下測定標準系列的吸光度。以吸光度(Y)對多酚濃度(X)作圖，得回歸方程Y=132.3X-0.001 7，R2=0.999 9。在同種方法下測定不同樣品的吸光度，代入標準曲線方程，計算各溶劑萃取物樣品的總多酚含量。

1.2.4 抗氧化能力測定

(1) 清除DPPH自由基能力的測定：根據文獻[9]，修改如下：取一定質量的樣品，用30%的乙醇溶液溶解配成不同濃度的樣液。分別向比色管中加入1 mL樣液，再加入0.1 mg/mL的DPPH溶液1.6 mL，最后用無水乙醇定容至6 mL。搖勻避光保存30 min后，在517 nm波長處測定吸光度，每個樣品平行測定3次。按式(2)計算清除率：

(2)

式中：

R0——自由基清除率，%；

A1——待測體系的吸光度；

A2——不加自由基體系的吸光度；

A3——不加樣液體系的吸光度。

(2) 清除ABTS自由基的測定：根據文獻[10]，修改如下：取7 mmol/L的ABTS溶液50 mL與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液50 mL混合均勻后，置于暗處反應12～16 h，制備ABTS+·溶液。使用前用蒸餾水按1∶40(體積比)進行稀釋，使得ABTS+·溶液吸光度在734 nm處為0.698。取0.2 mL樣液與4 mL ABTS+·溶液混勻，室溫下反應10 min后。測其吸光度，平行測定3次，清除率按式(2)計算。

(3) 總還原能力測定：根據文獻[11]修改如下：取0.5 mL 樣液，加入1 mL PBS(0.2 mol/L，pH=6.8)溶液， 1%六氰合鐵酸鉀溶液1 mL混勻，于50 ℃水浴20 min后，快速冷卻至室溫。加入10%三氯乙酸溶液1 mL，混勻后離心10 min，取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸餾水和0.1%氯化鐵溶液0.5 mL，靜置10 min后，在700 nm處測其吸光度記為Ai，用蒸餾水代替樣液測得A0。每個樣品平行測定3次。

1.2.5 對α-葡萄糖苷酶活性的抑制 根據文獻[12]修改如下：分別向離心管中加入樣液0.2 mL， 0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶0.2 mL，于37 ℃的恒溫水浴鍋中反應10 min后，加入5 mmol/L的PNPG 0.1 mL，在37 ℃條件下繼續反應15 min后，加入0.2 moL/L的Na2CO31.4 mL終止反應，用0.1 moL/L pH=6.8的緩沖溶液定容至10 mL。在402 nm處測定其吸光度，平行3次，按式(3)計算抑制率。

(3)

式中：

R1——對α-葡萄糖苷酶的抑制率，%；

A空——不加樣液體系的吸光度；

A樣——待測體系吸光度；

A背景——不加酶體系的吸光度。

2 結果與分析

2.1 明日葉不同極性溶劑萃取物總黃酮和總多酚的含量

由表1可知，不同部分的樣品得率相差較大，粗品得率為23.42%，經大孔樹脂純化后的樣品得率為2.35%，而不被吸附的過柱液部分得率較高。純化后的樣品經不同極性的溶劑萃取后，各相萃取物得率相差不大，其中水相的得率最高。說明大孔樹脂純化部分樣品中水溶性物質較多。

粗品經大孔樹脂HPD-600純化后，總黃酮含量提升近6.3倍，總多酚含量提升近5.8倍。而過柱液中總黃酮和總多酚含量較低，說明HPD-600樹脂對明日葉中的黃酮可以很好地富集。純化后的樣品經不同極性溶劑萃取分段后，各段的總黃酮和總多酚含量相差較大，乙酸乙酯部分總黃酮和總多酚含量最高，說明明日葉中的黃酮類物質屬于中等極性。

2.2 明日葉不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性

不同極性溶劑萃取物清除DPPH·效果見圖1、表2。由圖1可知，不同極性溶劑萃取物對DPPH·的清除能力隨著濃度的增加而增強，最終趨向平穩；但不同萃取物在相同濃度下，清除率相差較大。由表2可知，清除DPPH·的能力大小依次是VC>乙酸乙酯相>大孔樹脂純化品>正丁醇相>水相>粗品>過柱液。

不同溶劑萃取物清除ABTS+·的效果見圖2、表2。由圖2可知，不同極性溶劑萃取物對ABTS+·的清除率隨濃度的增大而增大，且對ABTS+·的清除能力相差較大。由表2可知，清除能力依次是VC>乙酸乙酯相>大孔樹脂純化品>正丁醇相>水相>粗品>過柱液。

由圖3可知，不同極性萃取物的還原能力隨濃度的增大而增強，還原能力依次是VC>乙酸乙酯相>大孔樹脂純化品>正丁醇相>水相>粗品>過柱液。

Figure 3 Ferric-reducing antioxidant power of different polar solvents of extracts fromAngelicaKeiskei

綜上所述，明日葉不同極性溶劑萃取物清除DPPH·、ABTS+·及總還原能力順序均為VC>乙酸乙酯相>大孔樹脂純化品>正丁醇相>水相>粗品>過柱液，表明不同極性部位樣品的抗氧化能力大小順序是VC>乙酸乙酯相>大孔樹脂純化品>正丁醇相>水相>粗品>過柱液。而各樣品的總黃酮、總多酚的含量順序與其抗氧化能力順序一致，即存在正相關性，說明黃酮、多酚是明日葉主要的抗氧化物質。而乙酸乙酯相的黃酮、多酚含量最高，因此乙酸乙酯抗氧化活性最強，活性物質也較多。

2.3 明日葉不同極性溶劑萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

α-葡萄糖苷酶在人體糖類的代謝過程中發揮重要作用，α-葡萄糖苷酶抑制劑可以降低酶的活性，減緩碳水化合物的分解，使得血糖降低[13]。體外降血糖活性多采用以PNPG為底物的酶抑制劑篩選模型來衡量物質對α-葡萄糖苷酶的抑制活性[14]。各樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制效果見圖4、表2。由圖4可知，抑制率隨著樣品濃度的增加而增加。由表2可知，抑制率依次是阿卡波糖>乙酸乙酯相>水相>大孔樹脂純化品>正丁醇相>粗品>過柱液。可以看出明日葉乙酸乙酯對α-葡萄糖苷酶有很好的抑制作用，在0.5 mg/mL時，其抑制率能達85%，與阿卡波糖的抑制作用相差不大。因此，對α-葡萄糖苷酶抑制活性最強部位為乙酸乙酯部位，由于乙酸乙酯總黃酮含量高達73%，總多酚含量達27%，推測其活性物質可能為黃酮、多酚物質。可以從乙酸乙酯相進一步分離其活性物質，此外，水相部位黃酮、多酚含量低于大孔樹脂后樣品，但其α-葡萄糖苷酶抑制活性卻高于大孔樹脂純化后的樣品，說明水相中存在非黃酮、多酚的活性物質，有待進一步深入研究。

3 結論

明日葉不同極性溶劑萃取物均有較強的還原能力并能有效地清除DPPH、ABTS自由基，具有良好的抗氧化活性，抗氧化活性最強的是黃酮、多酚含量最高的乙酸乙酯相，其他萃取物的抗氧化活性強弱順序均與總黃酮、總多酚的含量大小順序一致，即抗氧化活性與總黃酮、總多酚含量呈正相關關系，說明明日葉中總黃酮、總多酚是主要的抗氧化成分之一。在對α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定中，發現，不同極性萃取物均有一定的抑制活性，其中總黃酮含量最高的乙酸乙酯相萃取物活性最高，與阿卡波糖的抑制效果相當，其次，水相萃取物的抑制活性也較強，但黃酮含量不高，說明在水相萃取物中可能含有其他的活性物質，有待進一步研究。通過對明日葉不同極性萃取物的抗氧化活性和對α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定證實明日葉中的活性最強的部位在乙酸乙酯相，可通過進一步的分離純化得到有效成分，為明日葉產品的開發利用提供理論依據。

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The studies onactivities of extracts fromAngelicaKeiskeiusing different polar solvents

ZHU Fang1WEIWan-li1DUYing1CHENTing1ZHOUQing-di2LIAOLi-ling1

(1.SchoolofChemistryandMaterialsScience,GuizhouNormalUniversity,Guiyang,Guizhou55000,China2.SchoolofChemistry,theUniversityofSydney,Sydney2006,Australia)

In order to compare the activities of different extracts using several polar fractions of extracts fromAngelicaKeiskei, the crude extracts were adsorbed by HPD-600 macroporous resin, and 50% ethanol eluents were collected as products. The products were separated into three different polar solvents for extracting, i.e., ethyl acetate fraction, n-butanol fraction and aqueous fraction, and extracted by organic solvents of different polarities based on liquids-liquids extracting method. Moreover, the contents of total phenolic and flavonoid in different extracts were determined, and then the activities on scavenging DPPH, ABTS radical, ferric-reducing power and inhibiting toα-glucosidase were also studied. The results showed that the ethyl acetate-soluble fraction had high contents of total phenolic and flavonoid with the strongest antioxidant andα-glucosidase inhibitory activities. The antioxidant activity and inhibitory rate ofα-glucosidase of the extracts fromA.Keiskeiincreased according with the their concentration increasing.

AngelicaKeiskei; antioxidant ability;α-glucosidase; inhibitory activity

貴州省科學技術廳中藥現代化攻關項目(編號：黔科合ZY字【2012】3012號)；貴陽市科技局現代藥業計劃項目(編號：筑科合同[2012204]號)；教育部春暉計劃(編號：Z2016012)

朱芳，女，貴州師范大學在讀碩士研究生。

廖莉玲(1963—)，女，貴州師范大學教授，碩士。 E-mail:lll6383@163.com

2016-12-11

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.033